技术文章库
摘要： 细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一,所用材料为细胞计数板、巴氏吸管和显微镜,步骤如下.
一、细胞计数
取清洁计数板和专用盖玻片,用丝绸布轻轻擦干.
在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数.代入下式得出细胞密度.
台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率.一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色,活细胞不着色.此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色,或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝.
在进行细胞计数操作时,必须把细胞悬液准备好,细胞应分散良好,并充分混匀,若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时,需重制细胞悬液,重新计数.
细胞生长曲线是细胞培养实验中zui基本的指标,是测定细胞JD增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法.常用的方法为：在同一规格的培养瓶中,接种等量的同一代细胞,经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数,以培养时间为横坐标,不同时刻的细胞数的对数为纵坐标,标出各点并连成线,即为该细胞的生长曲线,可反映出细胞生长的动态.
也可采用MTT法来进行生长曲线测定.
细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度,经1个生长周期达到zui大活细胞浓度比例.
三、细胞分裂指数
细胞准备.用支持物盖片培养法.
显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数.逐个视野进行,对每一时间组的盖片各取细胞多、中、少的区域各一个,共计算1000个细胞,计算出平均分裂细胞所占百分比.观察时要掌握好分裂象标准,主要是确定好划分间期和前期,末期和间期等的界限,以减少误差.
四、细胞接种存活率
取对数生长期细胞,用消化法制成细胞悬液,计数后按检测细胞生长曲线接种细胞的原则,将细胞接种于培养瓶中,接种12-15瓶.
接种存活率（贴壁率）=（贴壁村活细胞数/接种细胞数）X 100%
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆的细胞必为贴壁和有增值活力的细胞.克隆形成率反映细胞群体依赖性和增值能力两个重要性状,由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率低,传代细胞系高；二倍体细胞克隆形成率低,转化细胞系高；正常细胞克隆形成率低,肿瘤细胞高.并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在皿中,持续1周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养.
取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在含10%胎牛血清的RPMI培养基中备用.
经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养,弃去上清,用PBS小心浸洗2次.加纯甲醇或醋酸/甲醇（1：3）5ml,固定15min.然后去固定液,加适量吉姆萨应用染液染10-30min,然后用流水缓慢洗去染液,空气干燥.
克隆形成率=（克隆数/接种细胞）×100%
2、软琼脂培养克隆形成试验
按1：1比例让1.2%的琼脂糖液和2XDMEM培养基混合后,取3ml混合液注入直径6cm平皿中,冷却凝固作为底层琼脂,置CO2恒温箱中备用.
把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数,计算克隆形成率.
