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1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：
反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度
去离子水 1 29.4
4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L
有义引物 5 2.6 0.25μmol/L
模板 7 2 0.1μg
3. 振荡每只管，然后短暂离心。
预变性 94℃ 4分钟 1次
变性 94℃ 1分钟
延伸 72℃ 1分钟
保存 4℃
6. 紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论
1.假阴性，不出现扩增条带
模板：①模板中含有Taq酶YZ剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：
②减低酶量或调换另一来源的酶。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4.出现片状拖带或涂抹带
差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：
②减少dNTP的浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
