变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

核苷酸

浓氨水TBE丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺TEMED尿素过硫酸铵TE

真空旋转蒸发仪电泳仪

1.  用浓氨水将合成的寡核苷睃从可控孔度玻璃拄上洗脱下来。于55℃加热5 h 以上。

表1、变性聚丙胺凝胶电泳能使相应片段达到最适分离度的丙烯酰胺浓度

8.  临加样前用移液器上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔。
9.  加样，在约5 V/cm2电压降下电泳至溴酚蓝到达胶底部。

10.  将凝胶板从电泳槽中取出，水平放置，撬开上层板。
11.  用塑料膜覆盖凝胶，将板翻转，将凝胶的一角揭离玻璃板，放在塑料膜上，再用另一张塑料膜覆盖凝胶。
12.  将凝胶放在带荧光指示剂的薄层层析板上，用短波紫外灯跟踪观察条带，条带将在绿色背景下显示暗迹。

13.  一个干净的解剖刀将条带直接切下或用墨水标记后切出，剥去塑料膜，将胶条转移至离心管中。

14.  每2 cm 的胶条加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸钠，室温下在旋转揺床上洗脱过夜。
15.  将溶液转移至一个干净的离心管中，不要带入丙烯酰胺碎片。
16.  用等体积的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，样品用TE缓冲液或水重悬。

1. 灌胶后一旦拔去梳子，必须立即彻底清洗加样孔，否则由梳子带出的少量聚丙烯酰胺将会在孔中聚合，从而产生会使 RNA 条带变形的形状不规则的加样孔底面。

2. 用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳，因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿，使 RNA 的迁移发生严重变形。

3. 在电泳前进行预电泳，使过硫酸铵迁移出样品孔，并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度。