| 实验步骤 | 材料
将贮存液稀释释到适当的浓度。
10x 扩增缓冲液
为了避免碱基的错误掺入，在重叠延伸诱变反应中应使用带 3'—5'外切核酸酶校对能力的髙效热稳定 DNA 聚合酶。另外. 使用的 DNA 聚合酶一定不能具有催化非模板性掺入腺苷酸残基的能力。具备此种特性的 DNA 聚合酶包括 Puo DNA 聚合酶 (Boehringer Mannheim),rTth DNA 聚合酶 XL(Pwkin Elmer)。VentR DNA 聚合酶（New England Biolabs) 和 Pfu DNA 聚合酶 (Stmagene)。
请见步骤 6 和 11。
核酸和核苷酸
寡核苷酸引物
在 DNA 自动合成仪上合成的寡核苷酸引物一般不需要纯化，可直接用在重叠诱变中。
模板 DNA
如果热循环仪不配备加热盖装置，使用矿物油或石蜡油以防止 PCR 过程中反应混合物液体的挥发。
其他试剂
本方案步骤 11 需要的试剂列在第 1 章方案 17 或 19 中。
10x 扩增缓冲液 10ul
5umol/L 引物 FM(30pmoles) 6.0ul
热稳定 DMA 聚合酶 1~2 单位
10x 扩增缓冲液 10ul
5umol/L 引物 RM(30pmoles) 6.0ul
热稳定 DNA 聚合酶 1~2 单位
上述反应条件适合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反应体积，以及 Perkin-Elmer 9600、9700,Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC 100(MJ Research) 热循环仪。使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。
应根据诱变引物序列调节退火反应的溫度。
6. 各取以上两组 PCR 反应产物的 5% 进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳估计扩增靶 DNA 的浓度。
7. 用第 5 章中描述的方法之一纯化以上两组 PCR 产物。对产物进行纯化往往增加步骤 8 中所希望的扩增产物的产量。并可降低错误扩增产物的背景。（选做）
8. 在一个灭菌的 0.5 ml 的微量离心管或扩增管中混合以下试剂进行扩增反应，连接靶基因的 5'和 3'端。
PCR1 扩增产物（步骤 2) 约 50ng
10x 扩增缓冲液 10ul
5umol/L 引物 R2(30pmoles) 6.0ul
加水至 100ul
9. 如果热循环仪没有加热盖，用一滴轻石蜡油（约 50ul) 覆盖 PCR 反应液。将反应管置于热循环仪中。
10. 用步骤 5 给出的变性、退火、聚合反应所需的时间和温度进行扩增。
11. 取 PCR 反应产物的 5% 进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳估计扩增的靶 DNA 浓度。
所有 DNA 聚合酶在体外反应中都显示出可测量的错误掺入率。 |
|---|
