| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
10mmol/LKCl
0.5 mmol/L 苯
含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的细胞匀浆缓冲液
细胞重悬缓冲液
0.4mol/LKCl
10%(V/V) 甘油
0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽
40 mml/LTris-Cl(pH7.4)
0.15mol/LNaCl
Ficoll 溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。
甲酰胺染色液
10 mg 二甲苯青 FF
贮存于室溫。
MgCl2/CaCl2 溶液
5 mmoI/LCaCl2
聚乙烯醇溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。
终止液
1%(m/V)SDS
125ug/ml 酵母 tRNA
组织匀浆液
25 mmol/LKCl
0.5 mmol/L 亚梢胺
2mol/L 蔗糖
该缓冲液在使用前需要冰浴预冷。根据需要，步骤 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯（PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶YZ剂。
组织重悬缓冲液
1.5 mmol/LMgCl2
0.5 mmol/L 苯
贮存于 0°C。
台盼蓝染料（0.4%m/V)
酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）, 分装成小份并冻存在-20°C。恰好在步骤 3 以前把溶液以 1:100稀释于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。
凝胶
6% 或 8% 的变性聚丙烯酰胺测序胶（见第 12 章方案 8)
核酸与寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
通常由靶 DNA 片段进行 Maxam-Gilbert 测序实验中的（A+G) 反应组成。化学测序的方法请参见第 12 章的方案 7。此外也可以使用双脱氧终止法测序反应（第 12 章，方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端与 DNA 酶 I 切割得到的 DNA 片段的放射性末端相同。
放射性化合物
32P 末端标记的 DNA[长度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)]
反应中使用的 DNA 片段长度应该为 200~500bp。感兴趣的结合位点至少离放射标记末端 30bp。如果使用更长的 DNA 片段，测序胶的分辨率会变弱。结合位点离末壩太近可能不被 DNA 结合蛋白或 DNA 酶 I 识别。
离心机和转头
Beckman SW28 转头或类似产品，预冷到 4°C
带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器
橡胶棒
辅助试剂
新鲜组织、培养的细胞、来自细胞或组织的蛋白成分
方法
1. 用下列 3 种方法中的一种制备核提取物。此外，纯化细胞蛋白得到的组分可以直接用于步骤 2。
从组织制备核提取物
a. 解剖 10~15 g 组织并剪碎。加入冰冷的组织匀浆缓冲液，使碎组织的体积调整到 30 ml。用带紧型研杵的 Dounce 匀浆器勻浆，直到镜检确定大于 80%~90％ 的细胞已经破碎。
b. 检测裂解情况是用 10ul 细胞悬液加相同体积 0.4% 台盼蓝染液，在装有 20 倍物镜的显微镜下观察溶液。裂解的细胞吸收染液，被染成蓝色，而完整的细胞不被染色，仍然是透明的。继续进行组织匀浆直到大于 80%~90% 的细胞已经破碎。
C. 匀浆物用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中放入 10 ml 冰冷的组织匀浆缓冲液，取 27 ml 稀释的匀浆物铺在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min）在 4°C 离心 40 min。
d. 去掉上清，离心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把离心管放在冰上。
本方法适用于转染有质粒的细胞，这些质粒能表达编码转录因子的 cDNA。
a. 细胞用细胞淋洗缓冲液洗若干次。每个培养皿加入1ml 细胞淋洗缓冲液，用橡胶棒把细胞刮到缓冲液中。
b. 细胞悬液转移到 1.5 ml 离心管中，室温下用ZD速度离心 2 min 沉淀细胞。
c. 对于原来在每个直径为 150 mm 的培养皿中培养的细胞，加 300ul 细胞重悬液重悬细胞，然后进行 3 次冻融。
d. 在 4°C 以ZD速度离心 5 min 去掉细胞碎片。上清（即细胞裂解物）分装成小份贮存在-70°C。
2. 在 1.5 ml 离心管中加入：
32P 末端标记的 DNA 1~10fmol
H2O 加到 25ul
20%Ficoll 400 12ul
10% 聚乙烯醇 10ul
不含核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的对照 DNA
含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情况下培养后的靶 DNA
9. 用足够的恒定功率跑胶，温度维持在 45~50°C。
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