| 实验步骤 | 阶段 1:pTet-tTAK 稳定转染成纤维细胞
材料
缓冲液和溶液
溶液过滤CJ，然后以毎份 5 ml 分装，贮存在-20°C。
小牛血清（10%)
氯喹（10 mg/ml)
氯喹溶于水，溶液过滤除然后贮存在-20°C 。
请见步骤 2。
1X 胰酶-EDTA
0.5 mmol/LEDTA(PH8.0)
培养液
DMEM 完全培养液（Dulbecco's modified Eagle's medium complete)
100 单位/ml 靑霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
四环素-HCl 溶于 70% 乙醇，浓度 10 mg/ml, 贮存于-20°C。本方案中使用的含有 0.5ug/ml 四环素-HCl 的 DMEM 完全培养液 (含有或不含有选择性试剂）在 4°C 可以避光保存太约 1 个月。
含有 L-组氨醇（L-histidind) 和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液
100 单位/ml 青霉素
2 mmol/L 谷氧酰胺
125,250 或 500umol/L L-组氨醇（准备 125 mmol/L 贮液，在-20°C 贮存)
Irvine Scientific 公司（Santa Ana,California) 出售不含组氨酸的 DMEM。含有 0.5ug/ml 四环素-HCl 的选择培养液在 4°C 可以进光保存大约 1 个月。
特殊设备
塑料克隆环
这些方案可以缩小规模，那样需要的细胞少，使用的培养皿和培养板部小一些，并且所有组分按比例减少。
附加试剂
步骤 23 需要列在第 7 章方案 8 或附录 8 中的试剂。
载体和菌株
pSV2-His
关于 pSV2-Hia 的信息，请见 Damke 等（1995)。质粒 pTet-tTAk 和 pTet-Splice 在 Life Technologies 公司有售，其他带有选择标记的载体也有出售（如 Promege 公司有 pCI-neo，CLONTECH 公司有 pTK.HYG)。如果以其他载体代替 pSV2-His，要用适合该质粒所带选择标记的选择培养液。
带有靶基因开放阅读框的 pTet-Splice
本方案使用 NIH-3T3 细胞，但其他细胞当然也能用。细胞在合适的培养液中生长。
方法
培养和转染细胞
1. 在 DMEM 完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有 0.5ug/ml 四环素-HCl(四环素）的 DMEM 完全培养液中。每个 10 cm 培养皿中加入足量细胞, 使转染那天，细胞可以有 33% 的汇合度。
如果要共转染靶基因，那么带有靶基因的 pTet-Splice 重组体的加入量与 pTet-tTAk 的摩尔数相等。
用磷酸钙转染细胞的更详细内容请见第 16 章方案 2 和 3。
4. 吸掉步骤 1 准备的细胞培养皿中的所有培养液。
5. 用巴斯德吸管混合 CaCl2-DNA 若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。
6. 细胞在 37°C，5%CO2 条件下培养 30 min,15 min 后摇动培养皿，保证 DNA 沉淀物的均匀覆盖。
7. 每个细胞培养皿中加入 10 ml 含有四环素的 DMEM 完全培养液。细胞在 37°C，5%CO2 条件下培养 4~5 h。
甘油休克后，细胞看上去有些碎碎的是正常的。使用氯喹（步骤 7) 会进一步减低细胞的完整程度，但会提高转染效率。
10. 恰好在 2.5 min 的时候吸掉甘油溶液。操作得快一点，因为甘油对细胞毒性很大。
作为一般规則，细胞休克的最长时间应该允许有大约 50% 的细胞存活。
11. 立即又轻又快地加入 10 ml 含有四环素的 DMEM 完全培养液洗细胞。立即吸掉培养液，再重复洗涤。
转染后一共在 37°C 培养 48 h(即步骤 12 和 13 的总培养时间）。
转染细胞的筛选和克隆
14. 转染后 48 h, 细胞用几种稀释度分到含有 125umol/L 组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的培养液中。细胞密度为每个 10 cm 培养皿大约 1X106 到 3X104。含有大约 1X105 细胞的培养皿需要培养若干个。
15. 细胞在选择培养液中培养 4 天后，接着用 3~4 ml 含有 125umol/L 组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的选择培养液培养。
16. 集落形成后（通常经过大约 10~12 天选择培养)，换成含有 250umol/L L-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的选择培养液。
重要: 用 pTet-tTAk 稳定转染后，为了防止 tTA 表达及随后筛选髙表达 tTA 的克隆时的毒性作用，细胞必须在含有 0.5ug/ml 四环素的培养液中培养。
18. 用大约 100ul 磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加 2 滴 1X 胰酶-EDTA(~100ul) 并放置 30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到 24 孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有 1 ml 含 250umol/LL 组氨醇和四环素的选择培养液。
NIH-3T3 细胞可以在大约 4~7 天生长到 80% 汇合度；但是不同细胞系甚至不同克隆生长到 80% 汇合度所需的时间是不同的。
20. 细胞在含有 500umol/L L-组氨醇和四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行 1:5 到 1:10 稀释）。
细胞进行蛋白诱导表达测试
21. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。
23. 通过 Northern 分析或免疫印迹法测试细胞中 tTA 的诱导表达。然后如阶段 2 所述，用靶质粒转染表达 tTA 的细胞系。
阶段 2: 四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达 tTA 的 NIH-3T3 细胞
材料
缓冲液和溶液
小 牛 血 清（ 10%)
HEPES 缓冲液
磷酸缓冲液
酶和缓冲液
合适的限制性内切酶
1X 胰酶-EDTA
0.5 mmol/LEDTA(pH8.0)
培养液
不含组氰酸的 DMEM
100ug/ml 链霉素
10% 小牛血清
0.5ug/ml 四环素-HC1(溶于 70% 乙醇，浓度 10mg/ml, 贮存于-20°C。）
适当的时候加 3ug/ml 嘌呤霉素。
特殊设备
塑料克隆环
所有质粒都用 CaCl-液化乙锭梯度平衡离心（第 1 章方案 10）或层析柱纯化（第 1 章方案 9)。
带有靶基因开放阅读框的 pTet-Splice
细胞和组织
可诱导表达自调控 tTA 的稳定细胞系 （阶段 1)
方法
培养和转染细胞
1. 在含有 500umol/LL-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的 tTA 的稳定细胞系（阶段 1 中分离得到)。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的 10 cm 组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有 33% 的汇合度。
3. 进行阶段 1 中的步骤 3~13。
可以在几天内杀死所有未转染细胞的嘌呤霉素的ZD浓度需要在转染前依靠经验确定，而且随着细胞类型不同而有不同。3ug/ml 嘌呤霉素足以筛选转染的 NIH-3T3 细胞。嘌呤霉素在到的浓度范围内可以有效地杀死大多数类型细胞。
5. 细胞在选择培养液中培养 4 天后，接着用 3~4 ml 含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液培养。
6. 集落长好以后（选择培养 12~14 天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。
7. 用大约 100ul 磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加 2 滴 1X 胰酶-EDTA(~100ul) 并放置 30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到 24 孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1ml 含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和0.5ug/ml 四环素的选择培养液。
NIH-3T3 细胞可以在大约 4~7 天生长到 80% 汇合度；但是不同细胞系甚至不同克隆生长到 80% 汇合度所需的时间是不同的。
9. 细胞在含有 500umol/LL-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行 1:5 到 1:10 稀释)。
10. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞充隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段 3 介绍。
阶段 3: 分析转染钿胞中的蛋白质表达
材料
缓冲液和溶液
磷酸缓冲液
1X 蛋白样品缓冲液
抗体
灌胶所用的丙烯酰胺浓度要适于靶蛋白的观察，见附录 8。
培养液
含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素的选择培养液（含或不含 0.5ug/ml 四环素）
100 单位/ml 育霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
500umol/L L-组氨醇（由 125 mmol/L 贮液稀释，在-20°C 贮存）
Irvine Scientific 公司（Santa Ana,California) 出售不含组氨酸的 DMEM。
在稳定转染的 NIH-3T3 细胞中，通常诱导 6 h 后有 tTA 和靶基因的表达，诱导大约 12 h 后表达达到峰值。
如果用胰酶收获细胞，先用冷的不含钙和镁盐的磷酸缓冲液洗细胞，然后用冷的含有 10% 小牛血淸的选择培养液（根据需要，含或不含四环素）终止胰酶的作用。管子立即移到冰桶中。
5. 每个克隆和对照都转移 0.5X106 细胞到离心管中，然后所有管子在 4°C 以 3000r/min(低或中速）离心 5 min。
6. 加 1 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液洗细胞。如步骤 5 洗细胞，轻轻吸掉上清，不要扰动细胞沉淀。
7. 细胞沉淀放在冰浴上，在离心管架上方的孔中轻快地旋动管于使沉淀变松，然后把它冻存在-70°C。
准备裂解物
8. 细胞沉淀用 30ul 蛋白样品缓冲液重悬，轻轻地吹打细胞，然后振荡管子。
如果细胞裂解物不立即加到凝胶上，可以在-20°C 贮存，但是在上样前需要再次煮沸。
12. 用合适的时间跑胶（请见附录 8)。
13. 蛋白从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电转移到 PVDF 膜上，用合适的抗体检测（请见附录 8)。
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