| 实验步骤 | 材料
溶液和缓冲液
10XKlenow 缓冲液
酶与缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段
凝胶
变性聚丙烯酰胺凝胶
用方案 1 所述方法纯化引物。为确保有效记，反应液中引物浓度应 3~10 倍摩尔过量于 DNA 模板。
寡核苷酸模板
为保持反应底物的高浓度，应在尽可能小的体积中进行链延伸反应因此，使用溶于乙醇-水中的放射性标记 dNTP, 而不是溶于缓冲的水溶液中。适量体积的醇溶 [α-32P]dNTP 可在即将用于标记反应的微量离心管中混合及挥发干燥。为ZD限度减少前体化合物及探针的放射分解，尽可能在 [32P]dNTP 到达的当天进行探针的放射性标记。
专用设备
磷荧光粘贴标签（有商品供应）或极热级放射性墨水粘贴标签放射性墨水是由少量 32P 与防水黑色绘图墨水混合而成。在本方案中使用的墨水为“极热级”（手提式小型探测器计数大于 2000cps), 用一纤维尖笔将墨水点于粘貼标签上。应在纤维尖笔上贴上放射性物质专用标志胶带，妥善保管。化学发光标签可替代放射性墨水，可以从 Stratagene(Glogos) 公司购买。
在反应的任一阶段，dNTP 的浓度都不能低于 1umol/L 为保持反应底物的髙浓度，应在尽量可能小的体积中进行廷伸反应。
2. 在离心管中加入适量的寡核苷酸引物和模板寡核苷酸。
如有必要，反应过程中可取出小置（0.1ul) 样品，测定可被 10% 三（TCA) 沉淀的放射性的比例来监测反应的进程（参见附录 8)。
5. 用等体积甲酰胺加样缓冲液稀释反应混合液，于 80°C 加热 3 分钟，然后将全部样品加至变性聚丙烯酰胺凝胶。
6. 电泳结束后，卸下电泳装置，将聚丙浠酰胺凝胶黏附于一侧的玻璃上（详细操作见第 12 章的方案 11)。
通常掺入探针的放射性活度甚高，获得胶片图像的时间仅需数秒。
9. 胶片显影后，将放射性墨水的影像和放射性标签重叠，以定位探针在凝胶上的位置。切下条带，按第 5 章的方案 12 所述方法回收放射性标记的寡核苷酸。
|
|---|
