| 实验步骤 | 材料
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
过滤CJ，分装成 5 ml 的等份冻存。
甘油（15%V/V)1XHEPES 盐缓冲液。
21 mmol/LHEPES
137 mmol/LNaCl
6 mmol/L 右旋葡葡糖
过滤CJ， 室溫保存。
核酸与寡核苷酸
基因组 DNA
转染细胞前，基因组 DNA 必须切成 45~60kDa 大小（见步骤 2 与 3)。在预实验时按下述方法确定剪切 DNA 的条件：用规格为 22#的针头剪切 2 ml 的各等份高分子量 DNA, 剪切不同次数（如 3,4,5 或 6 次)。进行 0.6%(m/V) 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭或 SYBR 金染色。用线性噬菌体λDNA 的单体或二聚体作标记，优化其他搡作步骤需要将剪切成适当大小的 DNA 用无细咆的培养皿进行第 9 步操作。
带有选择性标志的质粒
末端带勾的硅化玻璃巴氏吸管
组织培养皿（90 mm)
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养物
方法
1. 实验DY天，以每 90 mm 培养皿 5x105 个细胞的密度，用适当的含血清生长培养基将指数生长的细胞（如 CHO 细胞）铺至培养皿上，在含 5%CO2 的 37°C 孵箱内培养细胞 16 h。
2. 第二天，按预实验确定的次数用规格为 22#的针头将高分子质量的 DNA 剪切成 45kb 至 60kb 大小的片段（见材料部分关于基因组 DNA 的说明）。
如果共转染选择性标志（见下面第 12 步的注释), 则加适当质粒溶液于基因组 DNA 中至终浓度 0.5ug/ml。
4. 取每等份 3 ml 的剪切的基因组 DNA 置于 12 ml 聚乙烯试管中（每等份 DNA 可用于转染 2 个培养皿)。
在光镜下要靠经验判断什么是"胡椒状"沉淀. 如果此时看到粉末状或团块状的沉淀，则终止实验。此步操作不能形成"胡椒状"沉淀或第 5 步溶液能变浑浊是由于所用 HEPES 缓冲盐溶液 pH 值不正确，第 5 步培养时间过长，或者是 CaCl2 或 DNA 浓度不合适造成的。
10. 大多数情况下，此时用甘油处理会增强转染效率。用甘油使细胞休克：
a. 吸去含磷酸钙-DNA 沉淀物的培养基。
b. 每培养皿细胞中加入预热至 37°C 的 1xHEPE 配置的 15% 甘油 3 ml。室温下培养不超过 3 min。
筛选期的长短、重铺细胞的密度与筛选条件均取决于互补或筛选的突交或基因《此步重铺细胞的密度在每 90 mm 培养皿 2.5X105 至 1X106 细胞之间。此参数根据用不同数目的细胞铺培养皿（不作转染）并进行筛选的经验而确定。从逻辑上讲，应该使细胞密度尽可能大同时又可有效地杀死非互补或无抗性的细胞。
用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室温下用 10% Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以纪录细胞克隆数目。Giemsa 染液应使用前用磷酸盐缓冲液或水新配置，用 Whatman1 号滤纸过滤。
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