| 实验步骤 | DY阶段 用荧光染料标记蛋白质
材料
缓冲液和溶液
20 mmol/L 磷酸钠
20 mmol/L 半胱氨酸/HCl 缓冲液（pH7.0)
N,N-二甲基甲酰胺（DMF)
硫代吲哚花菁（cy) 的琥珀酰亚胺酯染料共价结合到游离氨基（赖氨酸侧链α-氨基末端或 e-氨基）。Cy 染料以冻干态使用，所有情況下保证其处于干燥状态以避免与水反应。由于批与批之间可能存在差异，每一瓶中染料的量必须单独测定。在这里所举的例子中，用俄勒冈绿的琥珀酰亚胺酯（分子探针）来标记 MC5 PKCα抗体。
抗体
制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白时，请参考附录 8
专用装置
Centricon 浓缩器：YM10,YM30,YM100(分别切割 10、30、100kDa 大小的分子；Amicon)
凝胶过滤/分子大小排阻色谱柱（预装一次性 Econo-Pac 10DG;Bio-Rad)
蛋白 A-琼脂糖凝胶柱（Econo-Pac 的 2 ml 柱；Bio-Rad)
重要：消化过度（如超过 16 h) 将导致 Fab 片段裂解成较小的多肽。因此建议进行预试验，毎隔1h 取少量的消化液（约 5ul) 采用还原性 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分桁，在还原条件下，lgG 的重链和轻链会像 50kDa 和 25kDa 的多肽一样迁移。经木瓜蛋白酶消化的抗体按约 25kDa 大小的分子迁移。
3. 采用蛋白质 A-琼脂糖凝胶柱从 Fc 部分和未经消化的抗体中纯化 Fab 片段。将消化混合物加到平衡过的柱上，并按每份 1 ml 立即开始收集流过液部分。
一般来讲，可以在大约 3~4 个组分中发现 Fab 片段。
5. 使用 Centricon YM100 柱（截流值 10kDa;Amicon) 离心将合并的组分浓缩至体积 0.5 ml 以下。
6. 将样品加到 PBS 平衡的低分子质量（6kDa 以下）凝胶滤过层析柱上，用 PBS 洗脱 Fab 片段（按照产品说明进行)。
采用 Bradford 分析法测定 IgG 浓度，以牛血淸白蛋白作为标准品，并乘以系数 2。
Cy3 和 Cy5 在 554nm 和 650nm 的吸光系数分别为 150000L•nmol-1 和 250000L•nmol-1。
染料结合
10. 标记蛋白质时，将其混悬于不含游离氨基的缓冲液中。如果蛋白质溶液不是在一种适当的缓冲液中，则按上述第 6~7 步进行操作。
建议在标记反应过程中保持碱性 pH 条作（同时保持蛋白质的完整性），以便使赖氨酸的ε-氨基增加质子解离性并因而能有效地结合。
11. 蛋白质样品（抗体、Fab 片段或蛋白质）与 10~40 倍过量摩尔数的 Cy3 在室温反应 30 min(按第 8~9 步所描述的进行)。将染料非常缓慢地加入到用移液管尖头搅拌的溶液中（小心操作以避免染料直接与微离心管接触)。
ZJ的过量摩尔数以及反应时间都是根据经验来确定的。标记的目标是能使毎一个蛋白质分子与 1~3 个染料分子结合（对于标记比例标准的讨论，请参阅本方案的导言部分)。对于不同的蛋白质或抗体，其标记水平有很大的变化。如果ZZ的标记率太低，可能可以重新标记抗体。像 T(p)250 和 MC5 等抗体，已经成功地用超过 40 倍过量摩尔数的染料进行标记。
12. 加入ZZ浓度为10mmol/L 的含有游离氨基的缓冲液，如 Tris 等来终止标记反应。
13. 采用凝胶过滤柱系统（10DG,Bic-Rad) 来交换缓冲液以除去多余的未反应染料，并将蛋由质洗脱至 PBS 中。
b. 为了达到ZD分离，将标记反应的混合物直接加到树脂上，并注意使它的体积越小越好。
d. 另外加入 2 ml 缓冲液并收集可见蛋白质组分，将剩余物丢弃。标记产物将跑在前沿，并可以肉眼观察到，而游离染料从柱上洗脱较慢。
14. 采用 Centricon 浓缩器（可以截流适当大小的分子）再次对标记蛋白质进行浓缩。
15. 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析标记产物，以便验证蛋白质是否成功地被标记。产物经电泳分离后，直接用紫外透照仪（302nm) 检査凝胶上的可见标记产物。
对于大多数染料，在 302nm 的紫外激发是较好的选择。如果对凝胶照射时不能看到带，则可以考虑采用更短波长的激发光。
16. 标记反应以后，采用下述公式计算标记率：
Aλ X M / [ ( A280-ƒ X Aλ ) X ελ ]
式中 Aλ是染料在其ZD吸收波长λ处的吸收度，A280 是蛋白质在 280nm 的吸收度，M 是以 kDa 为单位的蛋白质分子质量，ελ是染料在波长 λ 处的摩尔消光系数，以 L•mmol-1•cm-1 为单位。公式以染料在 280nm 处的吸收进行校正。系数ƒ是染料在 280nm 和ZD可见吸收波校λ的吸收度比值。例如，Cy3 标记抗体的标记率公式就变为：
A554 X 170 / [ ( A280 - 0.05 X A554 ) X 150 ]
为了验证染料的结合是否会影响 Fab, 整个抗体或者蛋白质的生理功能，将标记产物与相应的未标记成分进行持异性活性比较。特异性活性包括催化活性或蛋白质结合活性。这些蛋白质结合分析可以采用琼脂糖固定的肽配体或磷酸酪氨酸颗粒来进行。这种结合活性测试的标准探作规程可以参阅《抗体技术实验指南 (Using Antibodies)》（Harlow and Lane1999)。(该书中译版已由科学出版社 2002 年 9 月出版。------编者注）
第二阶段 FLIM.FRET 分析的细胞制备
材料
缓冲液和溶液
可选，请参见第 1 步。
可选，请参见第 1 步。
这种低背景的荧光培养基可以从 Life Technologies 购得，或者采用经 Dulbecco 修改 Esgle's 的培养基的标准组成中除去下列成分以后的培养基：pH 标记物酚红、青霉素、链霉素、叶酸以及维生素 B2。使用前采用以 NaOH 调至 pH7.4 的无菌 HEPES(终浓度为 50 mmol/L) 来补充培养基。
除了考虑细胞株是否适合所研究的系统以外，选择细胞类型惟一需要考虑的就是通过—些方法可以方便地将它们固定（请参见第 1 步说明）。
方法
1. 将细胞移植到适当的表面进行显微观察：
对于转染后固定的细胞制品：将细胞移植到置于 6 孔或 12 孔组织培养皿中的玻璃盖玻片上。
对于悬浮细胞，固化柯以更方便地使用像明胶（0.1%,m/V,PBS; 高压灭菌）或聚 L-赖 氨酸（0.01% 水溶液，m/V) 等培养基。两种情况下, 均采用所选择的培养基覆盖小孔、盖片或者盖玻片约 30 min 来对上述材料表面进行包覆，再吸出过剩的培养基，然后，将细胞直接移植到培养基裏盖的表面。在转染操作过程中，细胞也可以保持在混悬液中，到成像前再立即固化细胞一旦固化后，就可以进行微注射了。
在有些情况下，必须梢确控制蛋白质表达水平。此时，建议在进行 FLIM 測定前先优化转染效率以及表达周期，可以采用调整的增强子来促进蛋白质的表达（请参见第 17 章)，或者采用核微注射来替代转染（请参见本方案结束处的“替代方案，活细胞的微注射”）。
4. 表达了目标蛋白质的细胞的鉴别。
5.(可选）如果实验设计允许, 选择第 6 步后面的替代方案，即微注射 (用于活细胞）或者固定和染色 (用于固定细胞)，中的一种方法来导入另一探针 (如: 标记蛋白）。
6. 在进行显微实验以前，立即用 CO2 非依赖性成像培养基（市售培养基或按材料项介绍的方法调整的经 Dulbecco 修改的 Eagle’s 培养基) 替换培养基。
第三阶段 FLIM·FRET 测量
材料
专用装置
放大器（ENI403LA 或 Intra-actionPA-4)
氩激光（Coherent,Innova70C)
宽带绝缘反射镜（2 个；Newport Corporation)
检测器
MCP，HamamatsuC5825 或 LaVision Picostat HR
CCD, 配备 Kodak KAF 1400 芯片的 Photometries Quamix
滤光器
GFP,OG(Q495LP,HQ5lO/20;Chroma)
Cy3(HQ545/30,Q565LP,HQ610/75;Chroma)
单面镀银反射镜（Zeiss)
曲镜座（2 个)，透镜支架（2 个)，标竿（5 个），以及后支架（5 个）（Newport)
倒置显微镜（Zeiss 135TV)
IPLab Spectrum(Signal Analytics)
可变光圈（Comar)
透镜（分别为焦距 12 和 7.6 cm、焦距 2.5 和 3.8 cm;Newport)
水银灯（100 W Zeiss;HBO 100 AttoArc)
Multimode fiber step-indexed 1-mm core(步长指数 1 mm 内核的多态纤维）
(Newport)
油接物镜（100X/1.4NA;ZeissFluar)
光学操作台（2X1m;TMC)
Power meter 和 head (Ophir,Nova Display 和 2A-SH)
配备 PCI-GPIB 卡（National Instruments) 的 Power PC(Macintosh)
快门（高速)Vincent Associates,UniblitzVS25)
快门启动器（Vincent Associates,UniblitzVS25)
驻波声-光调制器（acousto-optic modulator,AOM)(Intra-action,80MHz)
倍频合成器（IFR2023)
可变密度滤光器滑轮（Laser Components)
水循环冷却装置（Grant)
细胞和组织
按第二阶段所介绍的方法制备表达了蛋白质探针的细胞（活的或固定的)
方法
1. 调节波长选择棱镜，选定 488nm 的氩激光为激发波长。采用激光背面的控制旋钮微量调整高反射镜面的位置来优化输出功率。
2. 设定频率合成器来启动 AOM 至共振频率约为 40MHz(对于这里所介绍的实验，采用的启动频率为 40.112MHz)。这使得激光束以两倍于驱动频率（80.224MHz) 的强度振动。
3. 通过调节入射角的角度和用光度计监测非衍射零级光的强度来优化 AOM 的衍射以及调制强度。在优化的衍射角度（达到相应的ZD衍射）时零级光的输出功率最小。
4. 开启 MCP 和 CCD。将光阴极电压的基底值设为-2V, 并调整增益以匹配 CCD 的满动力范围。这取决于样品的荧光强度，并需要凭经验来确定。最理想的是，使增益值尽可能小以降低噪声。通常将 Hamamatsu C5825 的增益值设定为 1, 而 Photometrics Quantix CCD 的增益值设定为 3。将 CCD 的示值读数设定为 2X2 栅格。
5. 将主频率合成器驱动 MCP 的频率设定为驱动 AOM 频率的两倍（对于上面所举的例子即为 80.224MHz)。
6. 选择最合适的物镜来进行实验。在本例中使用的是 Zeiss Fluar 100x/1.4NA 油物镜。
7. 为了得到零级寿命参照图像，从强扫描开始每相隔 22.5°记录整个一周 16 张相位依赖性图像（例如：将一小片铝箔置于盖玻片或玻璃底平皿的成像表面)。
a. 将荧光滤器部件改为单面镀银反射镜，并用可变强度滤光滑轮将外来光的强度调至最小值。将聚焦点调整至铝箔表面。
当进行寿命成像时，我们建议随时监测相稳定性。我们的装置一小时内相位可以稳定在 0.3°以内。对于我们的装置，每小时记录并保存一组参照铝箔像序列。
8. 将外来激发光源保存为ZD（利用可变强度滤光滑轮）；这样系统就已经准备好可以采集细胞的图像资料。
9. 用 GFP 滤光器设置（分光器：Q495LP, 激发装置：HQ510/20) 获取一张供体图像。曝光时间设定为能达到 75% 的 CCD 动态范围（对于 12 位 CCD 为 3000 个计数)。在图像中选择感兴趣的区域来測定荧光寿命。
10. 制备供体荧光寿命图谱：
a. 获取两个邻近的、一个正相另一个反相循环的 16 张相位依赖性图像（间隔 45°相位）系列来校正相淬灭。按第 9 步的方法优化每一张相图的曝光时间设置。
b. 在没有样品照射的情况下获取另一张图像。将这张去除背景的图像从系列的所有相图中提取出来，然后将正相和反相循环中每一对相同相位的图像进行一级加和来修正供体的淬灭。
c. 由这些资料以及零级寿命参照图像（铝箔），按照本方案导言部分关于图像操作的讨论中所介绍的方法来计算供体荧光寿命图谱。
11. 记录受体的图像，然后将照明光源改为 100W 水银灯（Zeiss Attoarc) 来淬灭受体。将 Cy3 滤光部件（激发装置：HQ545/30; 分光器：Q565LP; 发射装置：HQ610/75chroma) 移到检测通路中。将曝光时间优化到可以占满 CCD 整个动态范围后，获取受体图像。在不能检测到 Cy3 荧光的条件下，关闭检測器部件，照射受体。
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