枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验——化学法

枯草芽孢杆菌168

SPI 培养基EGTASPII 培养基柠檬酸钠EGTA氢氧化钠KH2PO4K2HPO4MgCl2MgSO4葡萄糖酵母膏( NH4 )2SO4

培养箱培养皿锥形瓶紫外分光光度计接种环离心管

一、试剂配制

1.  SP 盐
0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。

2.  CAYE (100x)
2% Casamino acid，10%酵母膏。

3.  SPI 培养基
SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100xCAYE 溶液。
4.  SPII 培养基
SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2溶液。

5.  SP-A Salts Solution(500 ml) 

6.  SP-B Salts Solution(500 ml)
（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g
（2）121℃灭菌20 min。

7.  100xCAYE Solution(100 ml)

（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g 
（3）121℃灭菌20 min。

8.  SPI Medium(20 mL)
 SP-A Salts Solution：9.8 mL
 SP-B Salts Solution：9.8 mL
 (1%V)Glucose(50%w/v，115℃灭菌20 min) ：200 uL
 (1%V)100xCAYE：200 uL

10.  SPII Medium(6 mL)
SPI Medium：5.88mL
(1%V)50mM CaCl2 ：60uL
(1%V)250mM MgCl2：60uL

11.  100xEGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。

2.  转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37℃，250 r/min 培养过夜。

3.  第二天上午取160 ul 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37℃，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。

4.  取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 ℃，100 r/min 培养90 分钟。

5.  在上述SPII培养基的菌体中加入20 ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100 r/min 培养10 分钟。

6.  将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 ul DNA(DNA 量不能过高，不超过5 ug)，再于37 ℃，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。

1.  注意仪器用品的干净和无菌。