非同位素标记探针的酶法检测实验——碱性磷酸酶检测法

探针

PBS链亲和素HRPODAB双氧水甘油二氨基联苯胺碱性磷酸酶缓冲液

盖玻片水浴锅

1.  生物素酰化探针与切片杂交、洗涤、封闭，然后与链亲和素溶液温育（“辣根过氧化物酶法检测”，步骤1~4）。

2.  由0.1% Tween 20/PBS中取出玻片，吸去残液，勿使玻片干燥，加200 μl 生物素酰化碱性磷酸酶溶液于玻片上，加盖24 mm×60 mm 盖玻片。放入外裹以铝箔的加湿盒中， 置37℃温育30 min。

3.  从加湿盒中取出玻片，倾斜使盖玻片滑去，将载玻片放入盛有42℃ 0.1% Tween 20/PBS液的Coplin广口瓶中，置42℃振荡水浴5 min，并于42℃ 0.1% Tween 20/PBS重复洗片2次。

4.   将载玻片移至盛有42℃的pH9.5碱性磷酸酶缓冲液的Coplin 广口瓶中，于42℃摇动下洗涤5 min，更换缓冲液再洗5 min。

5.  将玻片放入外裹以铝箔、含有50 ml 新鲜配制的NBT/BCIP 底物溶液的广口瓶中，放于37℃或室温（减慢反应）暗处。直至显示至适当颜色（15~60 min）。
6.  室温下以PBS洗片5 min 终止反应。
7.  如需要，可作荧光复染，以鉴别胞核（“荧光原位杂交实验”基本方案，步骤9）。

8.  用90%甘油或适当的防褪色固片介质处理盖玻片，相差显微镜观察结果或照相。