| 实验步骤 | 1.培养 3~6L 细胞至浓度为 2X107~3X107 个/ml(OD50=1.0~1.3)。
2.离心收集细胞，并用冰预冷的水洗一次。
3.用冰预冷的 NP-40 缓冲液再洗一次后，转移到 50 ml 的离心管中。
4.离心收集细胞，用 10 ml NP-40 缓冲液重新悬浮细胞。
5.向干冰预冷的研磨杵和臼中加入液氮。在液氮挥发时，逐滴往磨臼内加入细胞。并注意添加液氮以保持细胞的冷冻状态。用力碾磨细胞 15 min。注意防止细胞的融化。
6.转移处理好的裂解物到冰预冷的烧杯，并让其在室温中融化。当边缘开始融化时，加人 20 ml 含有蛋白酶YZ剂的 NP-40 缓冲液（通常混合使用几种商业化的蛋白酶YZ剂）。
7.转移预处理好的裂解液到 40 ml 的 Nalgene 离心管中，用 SA-600 或类似型号的转头在 16500r/min 高速离心。
8.加入 1ml 琼脂糖 6B(Sigma) 的珠子（与 NP-40 缓冲液按 1:1 混合）。4°C 旋转摇动 30 mm。离心收集珠子。转移上清液到一个新的 50 mlFalcon 离心管。
9.加入 400ul 用 NP-40 缓冲液预洗过的琼脂糖 6Fast Flow IgG(Amersham)，并在 4°C 旋转摇动至少 2 h。
10.旋转摇动好的产物倒人 Poly-Prep(BioRad) 层析柱。自然重力压紧。
11.30 ml NP-40 缓冲液洗柱子一次。
12.10 ml TEVC 缓冲液再洗一次。
13.将层析柱装回收集管中，加人 lmlTEVC 缓冲液和 5 叫 TEV(tobaccoetchvirus) 蛋白酶。拧紧盖后，4°C 旋转摇动 2 h 至过夜。
14.吸取洗脱液并转移到一个封住底部的新层析柱中。
15.1.0 ml TEVC 缓冲液洗旧层析柱。
16.加 3 ml CBB(钙调蛋白结合缓冲液）到 TEV 上清液中，再在每毫升 TEV 洗脱液中加人 3ul 1 mol/L CaCl2。加 300jul 雀丐调蛋白结合珠子（Amersham) 于 CBB 中，珠子与缓冲液 1:1 混合后，4°C 平摇孵育 lh。
17.洗涤：
A.1ml CBB(0.1%NP-40) 洗 2 次
B.1ml CBB(0.02%NP-40) 洗 1 次
18.堵住层析柱底部，加入 1ml CEB(钙调蛋白洗脱缓冲液)。
19.收集DY部分 1ml 洗脱液到微量离心管中。
20.堵住层析柱底部，加人 lmlCEB。
21.收集第二部分 lml 洗脱液到微量离心管中。
22.合并两次收集液，分装成 50(VU750|ul，750/zl 三份到未硅化的微量离心管中。
23.用 100%TCA 溶液配制 25%TCA，冰浴 30 mm，间或振荡。
24.用ZD转速（13000r/min),4°C 离心 30 min。
25.用冰冷（一 20°C) 丙酮（含 0.05mol/L HCl) 洗一次后，在 4°C 下，ZD转速离心、5 min。
26.用冰冷（一 20°C) 丙酮洗一次后，在 4°C 下，ZD转速离心 5 min。
27.除去上清，真空干燥约 lOmin。
用 500ul 部分做 10% 的胶电泳银染。用 750ul 部分做质谱分析。
展 |
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