小鼠胚胎干细胞向神经干细胞的定向诱导分化

实验概要

小鼠胚胎干细胞向神经干细胞的定向诱导分化

主要试剂

• 无菌水、0.1%明胶、DPBS、0.05%Tripsin、fibronection、Laminin、细胞基础培养液、N2B27培养液、mES培养液C、小鼠EB培养基、神经干细胞培养液（NSC培养液）
  

主要设备

35 mm、100 mm培养皿、12孔板、移液枪、口吸管、玻璃管

实验步骤

（1）．经由EB分化法（Lee SH,2000）
②将在饲养层上培养的多能性干细胞以0.05% Trypsin消化2min，加等体积细胞基础培养液终止消化，1000rpm离心5min，弃上清并用神经干细胞培养液重悬细胞，以每皿2×10⁵个细胞密度加入明胶包被的35 mm培养皿，在37℃、5%CO2培养箱中静置30 min，吸取上清以去除贴在明胶上的滋养层。
6个细胞的密度接种于100 mm培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中静置48 h。以后每天向每个100 mm培养皿中补加3mL EB 培养基。
！注意：培养皿接种后，要将细胞悬液充分摇匀后再放入培养箱，否则EB之间容易黏合在一起。
⑤分化第6天,弃去12孔板中的fibronectin，每孔加入1mL EB培养基。吸取100 mm培养皿中的EB球置入12孔板中，每孔放置20个左右EB球。
！注意：在12孔板中吸液和加液要轻，枪头紧贴皿壁，以免吹起EB球。
⑧.0.05%Tripsin消化2min，用等体积的10%FBS终止，1000rpm离心5min，用NSC M重悬细胞，并以每皿5×10⁵个细胞的密度种植于35 mm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养。
5个细胞的密度种植于提前包被PDL和laminin的35 mm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养扩增。PDL和laminin的包被方法为：在新的35 mm培养皿中每皿加入50μg/mL的PDL 1mL，室温静置过夜；第二天弃去皿中的PDL液体，用无菌水冲洗皿底3遍，室温静置晾干，每皿加入5μg/mL的laminin 1mL，37℃、5%CO2培养箱中静置过夜，接种前弃去laminin。
①提前1 h用0.1%明胶包被35 mm培养皿，孵育1 h后弃去明胶。
5的细胞密度加入明胶包被处理后的35 mm培养皿，在37℃、5%CO2培养箱中静置30 min，吸取上清以去除贴在明胶上的饲养层细胞。
5每皿的密度接种于35 mm培养皿中
⑤按第④步的描述消化传代并以N2B27培养液重悬细胞，以每皿9.6×10⁴个细胞的密度接种于弃去提前1h包被0.1%明胶的35 mm皿中，并加入1μM的RA。
⑦ 再过6天后传代并以NSC 培养液重悬，以每皿5×10⁵个细胞的密度接种于提前包被了PDL和laminin的35 mm培养皿中，培养液为NSC培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养扩增。