人诱导性多能干细胞诱导

实验概要

人诱导性多能干细胞诱导

主要试剂

DPBS、0.25% Trypsin、1mg/mL胶原酶Ⅳ、丝裂霉素C、0.1%明胶、Polybrene、PE-TRA-1-60抗体、hESCs培养液、细胞基础培养液

• 条件培养液
  接种好的饲养层细胞换成hESCs培养液，第二天收集培养液，此培养液就叫条件培养液。条件培养液可以连续收集七天。用之前要用0.22 μm滤器过滤。
  

主要设备

35 mm培养皿，4孔培养板，滤器，2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL离心管，细胞计数仪，巴斯德管，倒置显微镜，培养箱，水浴锅，生物安全柜，体视镜

实验材料

供体细胞、4因子病毒

实验步骤

长满的人包皮成纤维细胞或者胎儿来源的成纤维细胞，按照常规的细胞传代方法，将供体细胞按2×104cells/cm2接种到12孔培养板的一个孔，24 h左右后使用，
（2）病毒进行感染
！注意：感染前用对照GFP进行标定，感染时根据标定的病毒滴度加入所需的病毒量。一般用不同滴度的GFP病毒感染细胞，摸索出刚好感染效率在80-100%的病毒量，如果病毒量过多，会导致被感染的供体细胞凋亡。
（3）hiPSCs诱导
！注意:使用现做的饲养层，而不选用冻存复苏的。
!注意：计数可采用普通的血球计数板计数或者自动细胞计数仪计数。
④观察细胞及其变化，大概7～10天后，会出现小克隆
⑥14天后开始准备挑克隆，提前一天准备饲养层，可以选择用24孔培养板进行DY次挑克隆，注意要一个克隆一个孔，重编程完全的克隆可以继续培养，
⑦供体细胞接种到饲养层后的第7天，饲养层细胞活力逐渐变小，有些开始凋亡，这个时候开始加条件培养液。