甲醛变性电泳

实验概要

本实验介绍了RNA电泳（即甲醛变性电泳）的原理及操作步骤等。

实验原理

提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。将RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。

主要试剂

1. DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2L去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。
0.2mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）                   

80mmol/L NaAc                                                                 

10mmol/L EDTANa₂                                                               

先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后，加入10ml 0.5mol/L EDTA，定容500ml。用0.22mm滤器过滤CJ，装入棕色瓶中，室温避光保存。

或0.2mol/L MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸）

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA
3. 1×MOPS电泳缓冲液（即1×甲醛变性胶电泳缓冲液1×running buffer）：1500ml
37%甲醛          80ml
4. 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）： 10ml

预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：
3.1ml      甲酰胺
720ul      37%的甲醛

16ul        水饱和的溴酚蓝
混匀，分装，-20℃保存，常用放4℃保存。

或  甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）： 10
1mmol/L EDTA
0.25％二甲苯氰

主要设备

1. 电泳设备

实验步骤

1．电泳槽用0.3%H₂O₂浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。
       琼脂糖                0.55g  
      10×MOPS         5ml
称0.55克琼脂糖加36ml DEPC水，微波炉加热溶解琼脂糖，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至50-60℃，加9ml 甲醛（37%）和5ml 10×电泳缓冲液，然后灌制凝胶，插入合适长度和宽度的梳子，于室温放置30分钟以上使凝胶凝固。
4．加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液（10×）
将凝胶预电泳15min，电压降为5-10 v/cm。随后加样品和标准物，以3-4v/cm电压降电泳，电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。

注意事项

1．每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0mg poly(A)  RNA。