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实验概要
本实验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。
实验原理
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
主要试剂
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
主要设备
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴。
实验步骤
1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序加入试剂。
表 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 | S1 | S2 | S3 |
粗酶液(ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
pH7.8磷酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3. 结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到ZH一次读数时间（min）。
注意事项
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
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