循环测序：利用 PCR 和引物末端标记进行双脱

ddNTP 延伸 终止混合物 酶及其缓冲液 AmpliTaq CS 或其他无外切酶活性的 DNA 聚合酶 循环测序缓冲液 热稳定的 DNA 聚合酶 核酸和寡核苷酸 模板 DNA

小离心管 或者微孔板 热循环仪

材料
溶液和缓冲液
贮存液、缓冲液和试剂的配方请参照附录 1。


dNTP 溶液：四种 dNTPs, 各 1.0 mmol/L
甲酰胺上样缓冲液



200 mmol/LTris-Cl(pH8.8)
2
热稳定的 DNA 聚合酶

寡核苷酸引物，5'端由 33P 或 32P 放射性标记

质粒、黏粒、λ噬菌体和噬菌体 M13DNA 以及通过第 1~4 章中任何方法得到的 DNA 都可以用作模板。表 12-12 表明了每种摸板的需要量（同时参考表 12-4)。
特殊装置
小离心管（0.5 ml) 或者微孔扳（柔软，热稳定，96 个 300ul 溶剂 U 型孔）
设计好的热循环程序（见步骤 5)。
方法
1.将每一种ddNTP混合物（参考表12-11)各4ul放入相应的0.5ml离心管或微孔板中。置于冰上。

2.在每管/孔中加人：
双链DNA模板                                                    10~100fm
5X循环测序缓冲液                                             2.0ul

33P末端标记的引物：使用5pm标准制备的由³³P放射性标记的寡核苷酸(参见附录方法：使用PCR和[a-³²P]dNTP内部标记进行的循环测序反应为保证测序混合物的化学计量。可在不增加反应体积的情况下将DNA量增加3倍（30—300fm）。
3.在1X循环测序缓冲液中将AmpliTaq CS聚合酶溶解至0.5~1.0U/ul。将1ul溶解好的酶溶液加入孔或管中。
4.轻弹管壁或摇动微孔板使物质混合。如果需要，在反应上加一滴矿物油，盖上管盖，2000r/m离心2s。确认矿物油未被紫外线照射过.否则会产生PCR的强YZ剂。
5.将管或微孔板放入PCR仪，预热到95°C。依据以下程序操作。