细胞凋亡检测-流式细胞仪检测技术

一、固定细胞的染色方法 
方法一 
2．3ml PBS洗一次。 
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。 

1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 
3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。 
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。 
2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析 
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 
4．PBS轻洗1次 
6．PBS轻洗1次。 
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析 
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 
4．PBS轻洗1次 
6．PBS轻洗1次。 
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 
10． 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。 
3）ISNT的流式细胞仪分析 
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 
4．PBS轻洗1次。 
6．PBS轻洗1次。 
8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 
10． 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。 
二、非固定细胞的染色方法 
1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。 
3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 
5．流式细胞仪分析。 
2）Annexin V/PI双染色法 
2．用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。 
4．500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。