突变型Cas9稳定表达的人肝腹水腺癌细胞；SK-HEP-1-mCas9-738操作步骤

细胞名称  突变型Cas9稳定表达的人肝腹水腺癌细胞；SK-HEP-1-mCas9-738操作步骤

形态特性   上皮样　

生长特性  贴壁生长

特征特性   该细胞是采用慢病毒感染的方式使SK-HEP-1细胞稳定表达突变型的Cas9蛋白，该蛋白可以降低基因编辑时的脱靶效率，经2.0ug/ml Puromycin筛选得到的单克隆，经Western Blotting验证该克隆可以表达Cas9蛋白，可直接用Crispr技术编辑基因组DNA。 

培养条件   MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts)  10%FBS；2.0ug/ml Puromycin

传代方法   1:2~1:6传代；2~3天换液1次。

传代情况  

冻存条件   基础培养基+5%DMSO+20%FBS　

支原体检测  培养法（-）　

STR   Amelogenin：X,X；CSF1PO：11,12；D12S391：18,18；D13S317：8,12；D16S539：12,12；D18S51：13,15；D19S433：12,15.2；D21S11：29,31,32；D2S1338：20,23；D3S1358：16,16；D5S818：10,13；D6S1043：11,11；D7S820：8,11；D8S1179：13,14；FGA：17,17；Penta E：13,21；TH01：7,9；TPOX：9,9；vWA：14,17；

同工酶  

染色体  

使用权限  A类

突变型Cas9稳定表达的人肝腹水腺癌细胞；SK-HEP-1-mCas9-738操作步骤细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1、准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L, D-葡萄糖2.5g/L, 丙酮酸钠 0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

2、培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3、冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。 

二、细胞处理：

1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 

2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 

突变型Cas9稳定表达的人肝腹水腺癌细胞；SK-HEP-1-mCas9-738操作步骤对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

　1)弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　2)加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

　3)按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

　4)将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 

突变型Cas9稳定表达的人肝腹水腺癌细胞；SK-HEP-1-mCas9-738操作步骤对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。