CF-1小鼠胚胎成纤维细胞，经mitomycin-C处理，P3,300万细胞

在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

（一）细胞未长至85%时，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到生物操作台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸去剩余培养液，只留6-8ml 培养液继续培养。

（二）细胞已长满（达 85-95%）。即可进行传代，具体步骤如下：

1.弃去培养液，用PBS洗涤1-2次，

2.加入1.0ml胰酶消化液，显微镜下观察细胞消化情况，若细胞回缩变圆、透亮、轻拍甁壁呈流沙样脱落，则迅速拿回操作台，加入等量或双倍的含10%血清的完全培养液，终止消化并轻轻吹打细胞，使其变成单细胞悬液，

3.将细胞收集于离心管中离心1000rmp/5min，弃上清，轻弹管底，将细胞弹散，

4.加入新鲜培养液重悬细胞，进行传代、冻存，

5.如果没有特别说明，建议收到细胞后的次传代比例为1:2。

注：1.观察细胞密度用（4X物镜）低倍镜观察，以便正确的判断细胞密度；观察细胞形态请用（10X或20X）高倍镜观察；

2.瓶中运输的培养液不能重复使用，请换新鲜培养液培养；

3.有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内；

4.收到细胞后，若发现培养瓶破损、漏液及细胞污染，请及时与我们联系。

保存

冻存条件：70%基础培养液+20%胎牛血清+10%DMSO

保存条件：液氮存储

常见问题及解决方案

1.培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2.细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。1-2小时后观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以去掉，留8-10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决