三、试剂盒组成
酶标板1块（包被有恩诺沙星卵清蛋白的偶联物）
标准液6瓶（1ml/瓶）：0ppb、0.2ppb、0.75ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb。
10×浓缩抗体……………………0.8ml
10×浓缩酶结合物………………1.6ml
显色剂A …………………………7ml
显色剂B …………………………7ml
终止液 …………………………7ml
10×浓缩洗涤液…………………50ml
说明书 ……………………………1份
四、 需要但试剂盒中不提供的器材和试剂
（1）设备
……微孔板酶标仪（450nm）
……天平：感量0.01g
……振荡器
……离心机
……离心管：15ml，50ml
……刻度移液管：10ml
……洗耳球
……微量移液器：单道20μl～200μl,100μl~1000μl
多道20μl～200μl
……容量瓶：100ml ,1000ml
……氮吹仪或旋转蒸发仪
……恒温箱
（2）试剂
……二氯甲烷
……蒸馏水
……乙腈
……NaOH
……Na2HPO4.12H2O
……NaH2PO4.2H2O
……正己烷
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都须注意：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1：0.1M NaOH溶液
称取0.4gNaOH加双蒸水定容到100ml。
配液2：PB缓冲液
称取0.52g Na2HPO4.12H2O , 0.088g NaH2PO4.2H2O
加蒸馏水定容到100ml。
样本前处理步骤
鱼、虾和鸡肉：
（1） 将鱼虾、鸡肉等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物，加入15ml离心管;
（2） 加入5ml乙腈，1ml 0.1M NaOH（即配液1）充分混合10min，3000转/分以上，离心10min;
（3） 取出4ml上清液，加入PB缓冲液（即配液2）2ml，混合均匀；
（4） 加入二氯甲烷5ml，充分混匀10min，3000转/分以上，离心10min。去上层，取下层有机相4ml到15ml离心管中（清亮无杂质）；
（5） 50℃用氮气吹干；
（6） 0.5ml PB缓冲液（即配液2）溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合2min，3000转/分以上，离心5min。
（7） 取下层50μl溶液分析。
样本稀释倍数1倍。
六、酶联免疫测定程序
测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖
住微孔板。
测定步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min以上，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
2、配液A：将50ml浓缩洗涤液（10倍浓缩）用蒸馏水稀
释至500ml备用。（可按需配置）
配液B：用配液A将10×浓缩抗体稀释10倍（即取
1ml10×浓缩抗体+9ml配液A）（临用时按需
配置）
配液C：用配液A将10×浓缩酶结合物稀释10倍（即
取1m10×浓缩酶结合物+9ml配液A）（临用时
按需配置）
3、加标准液或样品液50μl到相应的微孔中，然后加50μl抗体工作液（即配液B），用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。
4、小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（即配液A）300ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
5、加100μl酶结合物工作液（即配液C）到微孔板中，用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。取出重复步骤4
6、显色剂A和B以1：1充分混合后，加100μl到微孔中，并在37℃下避光反应15分钟。
7、加50μl终止液到微孔板中，在酶标仪于450nm处测定OD值。
七、结果
所测得的标准液和样品吸光度的平均值除以个标准液（0标准液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0标准液的百分吸光度值等于。
标准液的吸光度值（或样品）
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－-×100 = %吸光度值
0标准液的吸光度值
以标准品浓度的以10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数即为样品中所含恩诺沙星的量。
八、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.2ppb
样本检测限：
鱼、虾……………………1ppb
鸡肉 ……………………0.5 ppb
准确度：
鱼、虾等………………… 90±15%
鸡肉 ……………………80±15%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
九、特异性
与类似物的交叉反应率：
恩若沙星…………………
环丙沙星…………………107.89%
诺氟沙星…………………67.61%
培氟沙星…………………43.25%
氧氟沙星…………………23.27%
洛美沙星…………………6.01%
沙拉沙星…………………<0.5%
甲磺酸达氟………………<0.5%
十、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）
会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即 进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需要将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴 漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了 有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于0.6（A450nm<0.6 ）时，表示试剂可能变质。
8、在加入显色剂后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
9、该试剂盒反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十一、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
保存期：本试剂盒有效期为12个月。
提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
