登革热病毒荧光试剂盒（PCR法）
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产品库
| 品牌 | 自营品牌 | 供货周期 | 现货 |
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登革热病毒通用RNA检测试剂盒（荧光PCR法）
说 明 书
【产品名称】
通用名称：登革热病毒通用RNA检测试剂盒（荧光PCR法）
【货号】
VR-Ⅰ-401
【包装规格】
50Tests/kit
【预期用途】
本试剂盒可用于疑似登革热病毒感染患者标本中登革热病毒RNA的定性检测和登革热病毒感染的辅助诊断。
仅供研究、不用于临床诊断！
【检测原理】
本试剂盒采用One-Step Real Time PCR及TaqMan荧光探针技术,在登革热病毒通用病毒基因序列的高度保守区域设计引物及荧光探针，通过全自动荧光PCR仪对疑似登革热病毒感染患者标本中的登革热通用RNA进行扩增检测，从而实现对登革热病毒RNA的定性检测。
【试剂盒组成】
序号 | 组分 | 数量 | 规格 |
1 | RT-PCR Reaction Buffer | 1 | 375μl/管 |
2 | 登革热通用反应液 | 1 | 375μl/管 |
3 | 酶混合液 | 1 | 250μl/管 |
4 | 登革热通用阳性对照 | 1 | 50μl/管 |
5 | RNase Free H2O(阴性对照) | 1 | 100μl/管 |
【储存条件及有效期】
-20℃避光贮存，避免反复冻融。有效期12个月（请于有效期内使用）。
【适用仪器】
ABI PRISM®7900、ABI PRISM®7500、ABI PRISM®7300、ABI PRISM®7700、ABI PRISM®7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCyclerTM、Qiagen Rotor Gene等。
【样本要求】
样本采集后应及时检测，否则应-70℃保存，避免反复冻融，使用干冰或液氮运输。
【检验方法】
1.试剂准备（试剂准备区）
反应液组份 | 加量 (μl) |
RT-PCR Reaction Buffer | 7.5 |
登革热通用反应液 | 7.5 |
酶混合液 | 5 |
待测标本RNA | 5 |
总体积 | 25 |
2.样本处理（样本处理区）
2.1取200μl的待检样本及阴性对照样本进行核酸提取。病毒RNA可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等微量病毒RNA提取试剂盒提取，按相应说明书要求进行操作。提取好的RNA应及时用于检测，否则应 - 70℃保存。
2.2加样：在准备好试剂的PCR反应管中分别加入阴、阳性质控品、待测样本RNA各5μl，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
3.PCR扩增检测（扩增区）
待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，设定循环参数（请参照各类仪器的操作说明进行设置）。
步骤 | 温度（℃） | 时间 | 循环数（次） | |
1 | 逆转录反应 | 50 | 30分钟 | 1 |
2 | 预变性 | 95 | 5分钟 | 1 |
3 | 变性 | 95 | 10秒 | 40 |
退火、延伸及检测荧光 | 55 | 45秒 | ||
步骤3中55℃时荧光检测，检测通道：FAM | ||||
*注：ABI系列荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选择None。
4.结果分析
ABI7500荧光PCR仪:将 baseline设为3-15(根据实际情况，baseline cycler可在一定范围内变化),荧光阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的Z高点，且Ct值=40（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。
5.质量控制
试剂盒中提供阳性质控品、阴性对照各一个，对应Ct值分别为Ct阳、Ct阴；如试剂质量完好并操作正确，Ct阳< Ct阴，Ct阳<30，并呈现典型的S型扩增曲线，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。在每次检测中应设置阴阳性对照品。
6．实验结果的判定
在实验有效的前提下
Ct值≥38 （或undet） | 阴性结果 |
|
35≤Ct值<38 | 检测灰区，应重复测定两次 | 重复测定两次，Ct值≥38，阴性结果；其中1次Ct值<38 ，阳性结果,FAM通道阳性判断为感染登革热病毒 |
Ct值<35 | 阳性结果,FAM通道阳性判断为感染登革热病毒 | |
【实验结果的解释】
【参考值范围】
1.Ct值≥38（或显示为undet），阴性结果
2.Ct值<35，阳性结果
【检测方法的局限性】
1.样本在收集、处理、运输以及保存不当时，可能出现假阴性或假阳性结果。
2.如果反应中存在YZ物和过量的DNA、RNA模板时也可能出现假阴性。
3.实验操作的任何失误都有可能导致无意义的检测结果。
【产品的性能指标】
本试剂盒能检测出相当于103copies/ml的登革热病毒RNA；与非登革热病毒无交叉反应。
【试剂盒使用注意事项】
本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。
为保证实验结果的准确性和可靠性请使用已校准的移液器，选用进口一次性使用的PCR反应管、离心管、tip头等进行样本处理及配液等操作，所有用具应不含DNA酶和RNA酶。
实验应严格分区操作；各区物品,工作服均为专用,不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台以防污染。
本产品使用前应在室温充分融化，混匀并瞬时低速离心。
标本处理应在生物安全柜中进行，以保护操作人员安全和防止对环境的污染。
每次实验应设置阴阳性对照品。不同批号的试剂请勿混用，在有效期内使用试剂盒。
实验样品尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。
在-70℃保存的RNA样本，加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时低速离心后使用。
分装有反应液的反应管应扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。
加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免物质泄露污染仪器。
扩增完毕取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。
实验中用过的吸头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
工作台及各种实验用物品经常用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯进行消毒。
实时荧光PCR仪器使用前Z好预热30分钟，连续进行实验时，仪器Z好间隔一小时以上再使用。
实时荧光PCR仪需经常校正和清洁载样板板孔。
本试剂盒涉及的检测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《YL废物管理条例》相关要求。
本司还提供以下试剂盒
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