禽流感病毒(AIV-M)通用型单重荧光PCR检测试剂盒（定性/定量）

特别提示：包括禽流感病毒(AIV-M)通用型单重荧光PCR检测试剂盒（定性/定量）在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：禽流感病毒(AIV-M)通用型单重荧光PCR检测试剂盒（定性/定量）
产品货号：SYA320
产品规格：48次/盒|96次/盒

一、简介：
禽流感病毒实时荧光qRT-PCR检测试剂是按照美国农业部(USDA)的国际检测标准和我国《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.1-2004)而制备的商业化检测试剂盒。本试剂盒为中的探针报告基团为6-FAM，淬灭基团为MGB。本方法可定性检测所有亚型禽流感病毒。

二、用途：
本试剂盒适用于检测各种禽类喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液及细胞培养液等。可用于禽流感病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
荧光qRT-PCR反应液(AIV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1 管 50μL/管
阳性对照(AIV-PTC) 1 管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2003 )和《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.1-2004 )进行样品的采集。
6.2 样品RNA提取
可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。
（1） 取灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。
（2） 每管加入600 µL裂解液，分别加入被检样本200 µL，再加入200 µL氯fǎng，混匀器上振荡混匀5 s，于4℃ 12000 r 离心15 min。
（3） 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，加入-20℃预冷400µL异bǐng醇，吸取步骤(2)各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。
（4） 于4℃ 12000 r离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600µL 75％预冷乙醇，洗涤。
（5） 于4℃ 12000 r离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。
（6） 10000 r离心10 s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5 min～10 min。
（7） 加入10µL 无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000 r离心5 s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃ 冰箱。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(AIV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000r离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(AIV-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 real time RT-PCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 5 min
预变性 1循环 94℃ for 30 sec
PCR扩增(PCR amplification ) 40循环 94℃ for 5 sec
60℃ for 30 sec
在60℃延伸时收集荧光信号 。报告基团：设置为FAM。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照(AIV -PTC)：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明AIV核酸阳性。
（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明AIV核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行AIV qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明AIV核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
（2） 所有使用的离心管Z好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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