CRISPR/Cas9基因敲除技术服务

本技术服务提供基于CRISPR/Cas9技术的目的基因敲除用慢病毒或目的基因敲除的指定细胞株，并且无论是慢病毒和细胞株都经过金标准T7E1法的验证。特别是目的基因敲除的多克隆细胞株，仅需30天即可获得并可用于目的基因敲除后的功能检测。

• 碧云天CRISPR/Cas9基因敲除技术服务项目表：

服务项目	项目编号	全额预付特价(元)	半额预付特价(元)	零首付价(元)
CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒 (无T7E1验证)	T0405	8555	9555	10555
CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒 (T7E1验证)	T0408	8888	9888	10888
CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株 (T7E1验证)	T0411	9999	10999	11999
CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株 (T7E1验证、WB验证)	T0413	11111	12222	13333
CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞株 (双等位基因敲除)	T0418	25999	26999	27999
敲除用慢病毒与敲除多克隆细胞株	T0421	15666	17222	18777
相同基因敲除用慢病毒再次订购	T0423	4598	5058	5518
相同基因敲除多克隆或单克隆细胞株再次订购	T0425	1268	1395	1522
相同基因敲除的不同多克隆细胞株 (T7E1验证)	T0428	6666	7333	7999
相同基因敲除的不同多克隆细胞株 (T7E1验证、WB验证)	T0431	10999	11999	12999
相同基因敲除的不同单克隆细胞株 (双等位基因敲除)	T0435	22888	23888	24888
其它CRISPR/Cas9相关技术服务	T0437	询价	询价	询价
100个定制基因敲除细胞裂解液	T0438	询价	询价	询价
100个定制基因敲除细胞株	T0439	询价	询价	询价

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务优势：

1. 技术新：基于的CRISPR/Cas9技术，有效敲除目的基因并避免脱靶效应。
2. 标准严：可以提供经过金标准T7E1法验证的慢病毒或细胞株，也可以提供经过Western blot验证的多克隆细胞株。
3. 筛选快：碧云天自行研发了基于CRISPR/Cas9技术的sgRNA快速筛选和验证体系，确保了可以在Z短的时间内完成sgRNA的筛选和T7E1法验证，同时也降低了筛选成本。
4. 时间短：目的基因敲除的多克隆细胞株仅需30天即可完成；单克隆细胞株一般在60天完成。
5. 价格低：CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株低至11111元，基因敲除用慢病毒低至8888元。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务选购建议：

1. 对于CRIPR/Cas9技术不是很熟悉的用户，我们优先推荐选择T0411或T0413直接获取目的基因敲除的多克隆细胞株，这样就直接可以开始目的基因敲除后的功能研究了。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，我们优先推荐选择T0411和T0428或T0413和T0431。T0413和T0431增加了Western blot验证，敲除效果更有保障。
2. 对于CRISPR/Cas9技术比较熟悉，能自行进行多克隆或单克隆细胞株的筛选并能自行进行T7E1鉴定的，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0408，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0405。需要注意的是，T0405尽管经过我们的筛选，很可能后续T7E1验证会取得成功，但我们无法保证后续T7E1验证一定成功。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0411和T0428，或T0413和T0431，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0408或者T0405。对于T0408和T0405，我们推荐选择经过T7E1验证的T0408。仅当需要对大量基因进行基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除时，可以考虑选择T0405，此时可以节省一些费用并总是会检测到大部分基因被顺利敲除的。
3. 对于经费充足的情况下可以考虑选择T0418，直接获得经过测序验证的单克隆双等位基因敲除细胞株，省心省力。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务流程：

1. 用户下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书，发送至service@beyotime.com。
2. 双方确认并签订技术服务协议书，按照协议内容进行技术服务。

• 碧云天CRISPR/Cas9技术服务示例：

基于CRISPR/Cas9技术的X基因敲除细胞株的构建

1. 根据用户提供的目的基因名称和基因ID，查找基因序列。
2. 设计3-5条sgRNA序列。构建含puromycin抗性的sgRNA和Cas9表达质粒。

图1. 含puromycin抗性的sgRNA和Cas9表达质粒的图谱信息。

1. sgRNA切割靶基因DNA活性检测：

图2. sgRNA切割靶基因DNA活性检测和筛选。图中显示sgRNA1和sgRNA3有较强的切割活性，而sgRNA2的切割活性很弱。

1. 选择对靶基因DNA切割活性强的sgRNA和Cas9表达质粒，包装慢病毒并测定滴度。同时包装靶向GFP或无任何靶向的对照慢病毒并测定滴度。
2. 慢病毒感染目标细胞株，并用puromycin进行筛选。
3. 筛选获得的细胞株进行T7E1验证。

图3. 基因敲除细胞的T7E1法验证。敲除位点上下游设计PCR引物，提取细胞基因组DNA后进行PCR扩增。对PCR产物进行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切酶，只切割碱基错配的DNA)，敲除(knockout, KO)细胞的PCR扩增产物经T7E1消化后可见明显的切割条带，说明预期的敲除位点附近存在大量sgRNA引导Cas9切割形成的缺失突变。

1. 目的基因敲除的Western检测验证(由于涉及是否存在合适抗体用于检测的问题，本项内容不包含在常规的技术服务范围内，如果需要须另行协商)。

图4. 目的基因敲除的Western验证。筛选获得的阳性细胞传代2次后，取细胞制备蛋白样品，每孔的蛋白上样量为20μg。用抗目的蛋白X的抗体进行检测，检测Actin作为内参。标示sgGFP的为感染了靶向GFP的慢病毒后筛选获得的细胞，标示sgX的为感染了靶向目的基因X的慢病毒后筛选获得的细胞。

1. 目的基因敲除细胞的功能分析参考图5和6(本项内容不包含在常规的技术服务范围内)。

图5. 在诱导细胞死亡的条件下，只有敲除基因X的细胞可以存活。原始细胞(naive)及阴性对照细胞(sgGFP)约80%死亡。

图6. X基因敲除影响蛋白M的磷酸化。X基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中蛋白M被特定处理诱导的磷酸化被完全YZ(A)。在通过CRISPR/Cas9技术X基因敲除的细胞中进行相同的实验，实验结果与MEF结果一致(B)。