Real-Time PCR预混反应液（染料法)(40-60%)

特别提示：包括Real-Time PCR预混反应液（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：Real-Time PCR预混反应液（染料法)
英文名称：SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)
产品货号：WH0103
产品规格：125次|500次|5000次

本制品是Real-Time PCR专用试剂，使用简单方便，独特双组分热启动DNA聚合酶，添加独特H-Bond因子的Buffer体系和单独包装的ROX等优点外，因对Buffer精心调整，可更有效地减少引物二聚体和非特异性扩增的产生，使其具有更高的扩增特异性和广泛模板适应性的特点。

本试剂盒采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

本试剂盒中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占绝大部分比例，其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程，而Anti Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶，进入PCR循环后，每经过一轮95℃条件下变性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到酶活状态，而在整个PCR反应过程中，每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此，SuperReal PreMix Plus在整个PCR反应过程始终保持的DNA聚合酶活力，配合精心优化Buffer体系，从而可以获得高扩增效率，高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。

产品特点：
· SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶（化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)，从而构成酶活自动调节系统，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
·本产品Buffer体系平衡了K+和NH4+的比例，还特别添加了独特的H-Bond因子,能协同调整反应体系中的氢键作用力，使引物模板退火条件更加严谨，反应的专一性增强，重复性更好。
· SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。
·本产品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。

应用范围：
广泛地适用于在ABI（PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One/7500/7500 Fast）、Stratagen（Mx3000P/Mx3005P/Mx4000）、Roche、Bio-Rad和Eppendorf等各种荧光定量PCR仪上采用SYBR Green法进行基因表达分析和核酸检测等实验。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次	20μl×5000次
2×SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)	1.25ml	4×1.25ml	40×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml	10×1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml	50×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2×SuperReal PreMix Plus和50×ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15min，用以充分激活热启动酶。
2．本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
4．引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
5．引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
6．20μl反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

操作步骤：

一、建立Real-Time PCR反应体系：
请注意将2×SuperReal PreMix Plus和50×ROX Reference Dye避光保存。
1．溶解2×SuperReal PreMix Plus（如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制。

成分	50μl体系	25μl体系	20μl体系	终浓度
2×SuperReal PreMix Plus	25μl	12.5μl	10μl	1×
正向引物（10 μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM
反向引物（10 μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM
cDNA模板	-	-	-	-
50×ROX Reference Dye	-	-	-	-
RNase-free ddH2O	至50μl	至25μl	至20μl	-

*引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5 μM范围内调整。

几种常见仪器的Z适ROX Reference Dye浓度如下：
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等：5×（例如：5 μl ROX/50 μl体系)
ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1 μl ROX/50 μl体系)
Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：无需添加

二、进行Real time PCR反应：
建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进行三步法PCR扩增反应。

两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	15min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60-66℃△1	20-32sec*	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage)

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	15min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		50-60℃△2	20sec	退火	否
		72℃	20-32sec*	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage)

△1请先使用60℃ 32 sec（20 sec,30 sec,31sec.)进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在60-66℃范围内进行。
△2通常引物退火温度比引物的解链温度（Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。
*使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定见下表：
使用时Roche LightCycler/LightCycler 480请设定在20 sec。
使用ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在30 sec。
使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
使用ABI 7500时请设定在32 sec。

3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

进行RT-qPCR反应时的操作建议：
进行RT-qPCR反应时，有两种cDNA链合成试剂盒可以选择，分别是QuickQuant cDNA链合成试剂盒（WH0098)和BaiScript II cDNA链合成试剂盒（WH0099)。其中，QuickQuant cDNA链合成试剂盒是专为两步法RT-qPCR步实验配制的，具有高灵敏度的RT-qPCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly （A)+RNA合成链cDNA。该试剂盒中使用的逆转录酶Quant Reverse Transcriptase与通常使用的Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的AMV不同，是一种使用大肠杆菌工程菌进行重组表达的全新GX逆转录酶。该酶能够GX转录多种RNA模板，限度将RNA转录成cDNA链。

引物设计说明：
进行Real Time PCR反应时，PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高，反应特异性强的引物可以参考以下要求

1．引物长度：18-30个碱基。
2．GC含量：40-60%
3．Tm值：引物软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度也有关。上下游引物的Tm值要尽量接近。简单的Tm计算公式为：Tm = 4℃（G + C)+ 2℃（A + T)。一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。
4．引物及PCR扩增产物序列：PCR扩增产物长度Z好在80-200 bp之间。尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。避免上下游引物3′端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。引物3"端碱基不能有多于3个连续的G或C。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。避免引物3"末端碱基为T。引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。

常见问题：

1．无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
原因：DNA模板中存在YZ剂
解决方法：重新纯化模板或降低模板使用量
原因：Mg2＋浓度不合适
解决方法：使用2×SuperReal PreMix Plus时，PCR反应体系中Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度提高到5 mM。进行Mg2＋终浓度优化时，建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行实验。
原因：加样错误或试剂问题
解决方法：检查试剂浓度和保存条件，包括所使用的引物和模板。重复进行实验。
原因：热启动酶未能激活
解决方法：使用试剂时，请确保预变性条件为95℃ 15min，用以有效激活热启动DNA聚合酶。
原因：PCR条件、引物序列或浓度不当
解决方法：请确认引物未发生降解，引物浓度及PCR条件，浓度不当时，通常先尝试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好，请重新设计引物。
原因：起始模板问题
解决方法：检查起始模板的浓度，保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释，并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。

2．NTC出现较高的荧光值
原因：试剂污染
解决方法：建议使用新试剂进行实验。
原因：PCR反应液配制时发生污染
解决方法：采取必要的防污染策略（如使用带滤芯的枪头)
原因：引物出现降解
解决方法：可以使用变性聚丙xī酰胺胶检测引物降解情况。

3．出现引物二聚体和（或)非特异扩增
原因：Mg2＋浓度不合适
解决方法：使用2×SuperReal PreMix Plus的反应体系含有Mg2＋的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度增加到5 mM。建议每次增加0.5 mM Mg2＋浓度进行优化。
原因：PCR退火温度太低
解决方法：建议每次增加2℃进行退火温度优化。
原因：引物设计不合适
解决方法：考虑重新设计引物序列。
原因：PCR产物太长
解决方法：荧光定量PCR产物长度Z好在100-150 bp之间，而且不应该超过500 bp。
原因：引物出现降解
解决方法：可以使用变性聚丙xī酰胺胶检测引物降解情况。
原因：计量误差
解决方法：反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

4．定量值重现性差
原因：仪器方面的故障
解决方法：因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
原因：样品纯度不好
解决方法：不纯的样品会导致实验的重现性差。
原因：稀释的模板放置太久
解决方法：通过梯度稀释的模板Z好现配现用。
原因：引物质量下降
解决方法：尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。
原因：PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当
解决方法：扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物
原因：计量误差
解决方法：反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

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