荧光定量用链反转录预混合液

特别提示：包括荧光定量用链反转录预混合液在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：荧光定量用链反转录预混合液
英文名称：First strand RT-PCR premix for fluorescent quantitation
产品货号：ALH264
产品规格：20μl×50次

本品为一管式反转录预混Mix，5×RT MasterMix 中含有反转录链合所需的所有试剂（RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA 和RNase-Free H2O 即可进行反应。使得cDNA 的合成更加的方便快捷，特别适合cDNA 合成以后的两步法Real Time PCR 检测。

试剂盒组分：
5 ×RT MasterMix————————0.2ml
RNase free H2O—————————1ml

产品特点:
1.体系配制简单：本产品为预混Mix形式，只需加入模板RNA和水便可以进行反应。
2.反转录效率高：特殊优化的oligo dT和N6随机引物配比，反转录效率高。
3.反转录速度快：只需42℃，20 min即可完成cDNA链的合成。
4.通读复杂模板：能够用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板，合成cDNA片段长度zuì高可达12 kb。
5.后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

储存条件：-20℃，有效期一年。

除了荧光定量用链反转录预混合液,，我公司还供应以下相关产品：



名称：石蜡包埋组织直接RT-PCR试剂盒(免RNA提取)
货号：BTN131176
规格：30次

名称：NTP溶液(10mM)
货号：BTN70906
规格：0.5mL
本产品是ATP、UTP、GTP、CTP四种核苷酸的混合液，每种核苷酸的浓度为10mM，纯度在98%以上(HPLC检测)，不含DNA内切酶、DNA外切酶、RNA酶和磷酸酶的污染，可以直接用于体外RNA转录合成。使用浓度请参考相关手册。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期两年。

NTP的分子结构


名称：KOD DNA聚合酶
货号：ALH209
规格：250U|500U
本酶是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的3"→ 5"外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase 更高，保真性是Taq的约50倍，同时具有合成速度快的特点，聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍，Taq DNA Polymerase的2倍，达到100～138bp/秒，可以在短时间内获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR 产物，扩增所得的DNA为平末端，可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。高保真KOD对于dNTP纯度要求很高，因此建议用本酶配套的超纯dNTP mix。

产品组分：
KOD DNA Polymerase————————————250U
10×KOD Buffer——————————————1ml
SuperPure dNTP mix(10 mM Each)——————0.1ml

单位定义：75℃活性测定条件下，在30min内摄入10nmol的dNTPs使成为酸性不溶物时所需要酶的活性定义为1U。

储存条件：-20℃。

本制品别名：KOD酶

名称：高保真DNA聚合酶
货号：SY0057
规格：100U
Pfu DNA Polymerase 是基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/53，是Pfu酶的1/6；

与上一代Pfu DNA Polymerase相比，Pfu中添加了独特的延伸因子、特异性促进因子以及平台期解YZ因子，使其长片段扩增能力、扩增特异性性以及扩增产量方面得到了大幅度提升：1）使用λDNA、质粒等简单模板，Pfu 可以有效扩增长达40 kb的片段；2）使用基因组DNA等复杂模板，Pfu可以有效扩增长达20 kb的片段；3）使用cDNA模板，Pfu可以有效扩增长达10 kb的片段。此外，Pfu对PCRYZ剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。II Pfu中添加了在常温下能够YZ其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。

产品组份：
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
2×PCR buffer：1.25 ml×2
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
10×Loading buffer：1.25ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

1 推荐反应体系及反应程序

1.1 反应体系配制：
a. 所Pfu DNA Polymerase 是基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/53，是Pfu酶的1/6；

与上一代Pfu DNA Polymerase相比，Pfu中添加了独特的延伸因子、特异性促进因子以及平台期解YZ因子，使其长片段扩增能力、扩增特异性性以及扩增产量方面得到了大幅度提升：1）使用λDNA、质粒等简单模板，Pfu 可以有效扩增长达40 kb的片段；2）使用基因组DNA等复杂模板，Pfu可以有效扩增长达20 kb的片段；3）使用cDNA模板，Pfu可以有效扩增长达10 kb的片段。此外，Pfu对PCRYZ剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。II Pfu中添加了在常温下能够YZ其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。

产品组份：
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
PCR buffer：1.25 ml×2
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
10×Loading buffer：1.25ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

1 推荐反应体系及反应程序

1.1 反应体系配制：
a. 所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶zuì后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。、

ddH2O	to 50 μl
2×PCR buffer a	25 μl
dNTP Mix(10 mM each)b	1 μl
模板DNAc	optional
引物1(10 μM)	2 μl
引物2(10 μM)	2 μl
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)d	1 μl

【注】：a. 2×II PCR buffer中已含有Mg2+，终浓度为2mM。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 不同模板zuì佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：

基因组DNA	50 ng～400 ng
质粒或病毒DNA	10 pg～30 ng
cDNA	1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)

d. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将酶的使用量在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。II Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性，因此，如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
1.2 一般PCR反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性a	95℃	30 sec～3 min	1
变性	95℃	15 sec	25～35循环
退火b	56℃～72℃	15 sec
延伸c	72℃	30～60sec/kb
彻底延伸	72℃	5 min	1

【注】：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组/cDNA为3 min；
b.一般来说，退火温度设置为引物Tm值。如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找zuì适引物模板结合温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度，每次+3℃。

c.延长延伸时间有助于提高扩增产量。
1.3 长片段PCR 扩增：
*使用高质量的模板，提高模板使用量；
*使用长引物。
*当推荐程序无法进行扩增时，建议尝试下述Touch Down两步法PC
*Touch Down两步法推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	3 min	1
变性	95℃	15 sec	5
延伸	74℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	72℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	70℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	68℃	60 sec/kb
彻底延伸	68℃	5 min	1

2. 复杂样品的扩增
Pfu具有的长片段扩增能力、扩增特异性以及扩增产量，对许多PCRYZ剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。推荐扩增的样品类型：

样品类型	扩增方式	推荐操作方式（50µl体系）
全血	直接扩增	吸取1-5µl作为扩增模板
滤纸干血渍	直接扩增	剪取1-2mm2滤纸作为扩增模板
培养细胞	直接扩增	取少量细胞作为扩增模板
酵母	直接扩增	挑取单克隆或1µl菌液作为模板
细菌	直接扩增	挑取单克隆或1µl菌液作为模板
霉菌	直接扩增	挑取少量作为扩增模板
精液	直接扩增	吸取少量作为扩增模板
浮游生物	直接扩增	挑取少量作为扩增模板
植物组织	直接扩增	剪取1-2 mm2 组织作为扩增模板
小鼠尾巴	裂解后吸取裂解液扩增	吸取1-5 μl 裂解液作为扩增模板*
食品	裂解后吸取裂解液扩增	吸取1-5 μl 裂解液作为扩增模板*

*样品裂解液制备过程：

**Lysis Buffer：20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% SDS，pH 8.0。(需自备)

引物设计注意事项
1）引物3’端zuì后一个碱基zuì好为G或者C；
2）引物3’端zuì后8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；
4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。