直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai

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直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai细胞培养简介：
什么是细胞培养？细胞培养是从动物或植物中取出细胞，然后使其在合适的人工环境中生长。这些细胞可于培养前直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，或者也可来自已经建立的细胞系或细胞株。
1）原代培养：
原代培养是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增值直到占据所有可用基质（即：达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段。必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜培养基，从而对细胞进行传代培养，为其提供更多继续生长的空间。
2）细胞系：
首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系或者亚克隆。来自于原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系，见下文），随细胞的传代，生长能力的细胞会占据优势，导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。
3）细胞株：
如果将细胞系的一个亚群通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选择出来，则次细胞系就成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株往往会获得其他一些遗传学改变。
培养环境：
细胞培养的一大优势在于能够控制细胞生长的物理化学环境（即温度、pH值、渗透压、O2和CO2压力）和生理环境（即：激素和营养素浓度）。除温度外，培养环境均由生长培养基控制。
虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过对血清成分更好地了解、确定细胞增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境（即：细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用），现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。

直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai
人直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物是从人直肠上皮细胞和肿瘤细胞中提取的，人直肠上皮细胞和肿瘤细胞分别从正常人直肠组织和肿瘤组织中制备。正常人直肠组织和肿瘤组织采集自各地方医院，采集工作根据IRB 和 HIPAA批准的方案进行。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。        cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 μl cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证产品的质量。        蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mM Tris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人血管组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。        潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。
直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai一、所需仪器：
离心机
生物安全柜
电动移液器
CO2培养箱
倒置显微镜
液氮罐
恒温水浴锅
直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai二、所需试剂：
胎牛血清（FBS）
无菌1×PBS pH=7.2
完全培养基
三、所需耗材：
离心管（15ml、50ml）
T-25细胞培养瓶
一次性无菌移液管（2ml、5ml、10ml）

锚蛋白重复域28抗体 英文名称：ANKRD28 0.2ml
活化复制因子2抗体 英文名称：ATF2 0.1ml
转录辅助因子退变样蛋白3抗体 英文名称：VGLL3 0.2ml
血管紧张素Ⅱ受体2抗体 英文名称：AT2R2 0.1ml
大鼠基质金属蛋白酶7MMP-7 ELISA kit  96T
小鼠糖原磷酸化酶同工酶MMGP-MM(Mouse Glycogen phosphorylase MM)ELISA Kit 96T
人铁蛋白FE(Human ferritin) ELISA Kit 96T
小鼠抗胰蛋白酶AT(Mouse Anti-trypsin) ELISA KIT 96T
人转化生长因子αTGF- Alpha(Human transforming growth factor Alpha) ELISA Kit 96T
同源盒蛋白H6亚型2抗体 英文名称：HMX2 0.2ml
罗丹明标记牛IgGBovine IgG/RBITC 0.3ml
直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai 156-10000 U/mL ELISA Kit for Human Leukocyte tyrosine kinase receptor
 0.312-20 ng/mL 人嘌呤霉素敏感性氨肽酶(PSA)ELISA试剂盒
 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Ferritin light chain
 0.312-20 ng/mL 人粘蛋白15(MUC15)ELISA试剂盒
 0.312-20 ng/mL 人硫辛酰胺酰基转移酶alpha支链-keto酸脱氢酶复合体,线粒体ELISA试剂盒
 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1 protein
 0.78-50 ng/mL 人5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(AA-NAT)ELISA试剂盒
 1.56-100 ng/mL ELISA Kit for Human Protein kinase C epsilon type
 78-5000 pg/mL ELISA Kit for Human Folate receptor beta
 0.312-20 ng/mL 人C-Mer原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)ELISA试剂盒
 0.312-20 ng/mL 人二氢喋啶还原酶(DHPR)ELISA试剂盒

直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai一、客户收到细胞先不开盖，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议受收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各一张），排除细胞本身污染的情况；
收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。
二、如为贴壁细胞，请在显微镜下观察细胞密度：
1. 未超过80%汇合度时，用75%酒精（建议配置75%酒精的水也是灭菌超纯水，喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作；然后打开盖子，先用枪头把培养基吸出10ml左右，放在离心管里，然后瓶口过火（严禁直接倾倒），这样可以保证不污染，再用10ml的移液管，将剩余的培液全部吸出，放于离心管中，培养瓶中只剩余10ml左右培液就可以了。培养16hr(时间根据细胞生长情况调整）之后，传代或者冻存。
2. 超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。具体步骤如下：
1) 弃去培养液，用3ml PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次；
2) 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于T25培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来；
3) 加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中，按要求分瓶。
三、如为悬浮细胞，吸出培养液，1000转/分钟离心5分钟，吸出上清，管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
注意：换液时一半用我们的培养基，一半用你们的，以免细胞不适应而造成生长不好。
直肠上皮细胞和肿瘤原代细胞提取物【Human Rectum MatchPair?: Normal Rectum Epithelial Cell Derivatives and Primary Tumor Cell Derivatives】品Pai四、细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
（1）细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、破损、漏液等，重发；
（2）冻存的细胞复苏后，绝大多数细胞未存活，重发；
（3）存活的细胞静置24小时后，绝大多数细胞未存活，重发；
（4）冻存的细胞复苏后或存活的细胞静置4小时后并且未开封，出现污染，重发；
（5）视具体情况而定。
五、细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
（1）客户造成细胞污染，不重发；
（2）客户不正确操作致细胞状态不好，不重发；
（3）细胞状态不好，未提供细胞培养前3天照片的，不重发；
（4）细胞培养时经其它处理的，不重发；
（5）细胞收到2天内，未告知，不重发；
（6）视具体情况而定。