大鼠胰岛细胞培养试剂盒【Rat Pancreas PrimaCell: Normal Pancreas Epithelial Cells】

原代细胞培养
大鼠胰岛细胞培养试剂盒【Rat Pancreas PrimaCell: Normal Pancreas Epithelial Cells】(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：
1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用   和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％   混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果：细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
产品说明
大鼠胰岛细胞培养试剂盒【Rat Pancreas PrimaCell: Normal Pancreas Epithelial Cells】
胰岛pancreatic islets (langerhans)是胰的内分泌部分，是许多大小不等和形状不定的细胞团，散布在胰的各处，胰岛产生的激素成胰岛素，可控制碳水化合物的代谢；如胰岛素分泌不足则患糖尿病。其中，大鼠导管上皮细胞主要功能：（1） 胰岛细胞移植是根治Ⅰ型糖尿病的研究方向，而导管上皮细胞是目前比较公认的胰岛前体细。（2） 体液传导。提供的大鼠上皮细胞，采用胶原酶消化制备而来。大鼠上皮细胞传5代以上仍可以保持原代细胞的分化状态，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 利用本公司试剂盒中提供的胰岛组织分离体系来分离，EDTA/EGTA处理过的胰岛组织能使得胰岛组织中细胞的一些功能特性发生改变，从而将胰岛细胞分离开来。本试剂盒适用于分离培养大鼠胰岛细胞。本体系提供了的组织分离条件，分离单个细胞的效率是已出版文献中所报道的5~6倍。此外，本体系还能保证所分离的细胞在培养基中具有很高的活性。利用的成纤维YZ体系，可以程度地降低所培养的胰岛原代细胞中成纤维细胞的含量。 大鼠胰岛细胞培养试剂盒适合于培养大鼠的胰岛细胞。本试剂盒包含： （1）OptiTDSTM大鼠胰岛细胞组织解离液（3×1ml） （2）大鼠胰岛细胞组织处理缓冲液（100ml） （3）FibrOutTM大鼠胰岛细胞成纤维YZ剂（1ml（500X）） （4）大鼠胰岛组织洗液（5 x 100 ml） （5）大鼠胰岛细胞生长因子（1ml500X）及血清（5x10ml） （6）大鼠胰岛细胞基础培养基（5 x 100ml） （7）大鼠胰岛组织预备液（1 x 100 ml） （8）大鼠胰岛细胞培养试剂盒使用说明书
传代细胞培养
大鼠胰岛细胞培养试剂盒【Rat Pancreas PrimaCell: Normal Pancreas Epithelial Cells】(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力Z好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

(二)操作：
1.将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。
2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。
3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
(三)结果:一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
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实验报告
一、大鼠胰岛细胞培养试剂盒【Rat Pancreas PrimaCell: Normal Pancreas Epithelial Cells】分离与培养：
    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；
    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
    6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。