北京Glucocoticoid Receptor/GR mRNA原位杂交试剂盒厂家

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名称：Glucocoticoid Receptor/GR mRNA原位杂交试剂盒
规格：100T
品Pai：百奥莱博
产地：国产|进口
编号：ZN0593
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：hμman,rat,mouse,rabbit
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Glucocoticoid Receptor/GR mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：Z重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以YZRNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Glucocoticoid的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
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编号	名称
ZN0484	EVC mRNA原位杂交试剂盒
ZN1004	Nociceptin mRNA原位杂交试剂盒
ZN0404	DMP1 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1812	大鼠MIP3 alpha/CCL20重组蛋白
ZN1865	超灵敏免疫组化试剂盒(抗兔IgG-HRP)
ZN1128	PIWIL2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1358	TBX2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN0411	Dopamine receptor2/DRD2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1079	P63 mRNA原位杂交试剂盒
ZN0897	MGMT mRNA原位杂交试剂盒
ZN1149	PlexinA2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1862	浓缩型免疫组化试剂盒 SABC-DyLight 488(POD)(人IgG)
ZN0104	ATM mRNA原位杂交试剂盒
ZN0924	MRC1 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1723	人TNFR2重组蛋白
ZN0291	CHUK mRNA原位杂交试剂盒
ZN0881	MAPKK2/MEK2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1360	TDRG1 mRNA原位杂交试剂盒
ZN0056	Androgen Receptor/AR mRNA原位杂交试剂盒
ZN1173	Prestin mRNA原位杂交试剂盒
ZN1575	人BMP7重组蛋白
ZN0313	collagenⅦ mRNA原位杂交试剂盒
ZN1715	人THBS1重组蛋白
ZN0681	HSD11B2 mRNA原位杂交试剂盒
ZN0840	LEF1 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1743	小鼠CCL21重组蛋白
ZN0618	GRP75 mRNA原位杂交试剂盒
ZN0623	GSK3β mRNA原位杂交试剂盒
ZN1544	中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
ZN0604	GNRH mRNA原位杂交试剂盒
ZN0576	GATA-6 mRNA原位杂交试剂盒
ZN1683	人MMP8重组蛋白
ZN0021	Activin A mRNA原位杂交试剂盒
ZN1696	人PAI-1重组蛋白
ZN1084	PAI-2 mRNA原位杂交试剂盒