6 X 组氨酸标记（His-tag）蛋白纯化

 6 X 组氨酸标记（His-tag）蛋白纯化试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 6 X 组氨酸标记（His-tag）蛋白纯化试剂是一种旨在通过氮川三乙酸镍金属亲和树脂的高度选择性结合，进一步温和洗脱，获得非变性或天然的重组标记目标蛋白的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于融合或标记在微小片段组氨酸上各种目标蛋白的分离纯化等。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，结合能力强（5－10毫克/次），回收纯度和效率高达95％。

技术背景

研究编码蛋白首先通过重组DNA技术在细菌中表达，并容易获得纯化的目标蛋白。其中6 X 组氨酸标记（Hexahistidine tagged fusion protein）蛋白系统有效地帮助获得纯化的目标蛋白。6 X 组氨酸标记系统与目标蛋白在各种表达系统，包括细菌、杆状病毒和哺乳动物里融合表达，其作为标记的组氨酸只有6个，在生理pH条件下不带电荷，几乎没有免疫原性，对目标蛋白的分泌、折叠、结构和功能没有影响。可以放在N端或C端，能够高度亲和Ni离子（Nickel－nitrilotriacetic acid；Ni－NTA）达到天然或变性条件下进一步纯化，从而得到满意的表达产物。除了6 X 组氨酸标记蛋白系统，还有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白系统、β－半乳糖苷酶融合蛋白、trpE融合蛋白、硫氢还原（Trx）融合蛋白系统等。

产品内容

平衡液（Reagent A）     3 X 500毫升

亲和液（Reagent B）      5毫升

洗脱液（Reagent C）      5毫升

产品说明书     1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

变性液（Reagent D）：用于变性融合蛋白纯化

透析液（Reagent E）：用于蛋白纯化后透析

细菌可溶性总蛋白样品：用于纯化的待测样品

1.5毫升离心管：用于反应操作的容器

50毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器

平式摇荡仪：用于混匀反应物

4℃台式离心机：用于沉淀反应物

4℃微型台式离心机：用于沉淀反应物

实验步骤

实验开始前，将试剂从－20℃冰箱里取出，在冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 从－70℃冰箱里取出用户自备的通过细菌扩增分离的细菌可溶性总蛋白样品
• 置于室温下15分钟，直至融化（使蛋白重新折叠）
• 移出5毫升样品（等于1升菌液萃取物）到50毫升锥形离心管
• 加入45毫升平衡液（Reagent A），用手混匀
• 加入1毫升亲和液（Reagent B），用手混匀
• 平放在平式摇荡仪上，在4℃温度下孵育60分钟，速度为50RPM
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为2500g
• 小心抽去上清液
• 加入50毫升平衡液（Reagent A），用手混匀
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为2500g
• 重复实验步骤9至10四次
• 加入1毫升洗脱液（Reagent C），用手混匀
• 平放在平式摇荡仪上，在4℃温度下孵育30分钟，速度为50RPM
• 转移到1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到预冷的新的1.5毫升离心管，置于冰槽里
• 或保存纯化的蛋白在－70℃冰箱里
• 或移取5微升进行SDS-PAGE电泳鉴定以及BRADFORD蛋白定量
• （选择步骤）透析处理

注意事项

• 本产品为5次操作
• 操作时，须戴手套
• 整个操作在4℃温度下进行
• 如果用户需要获得变性标记蛋白，建议使用变性液（Reagent D），整个操作在室温下进行
• 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品须完全可溶状态，否则影响蛋白的结合（例如包涵体）；建议使用不溶性融合蛋白溶解试剂盒（30016）帮助样品达到可溶性
• 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品在纯化前，须进行目标蛋白鉴定试验，例如IPTG测试；建议使用 HIS标记蛋白扩增试剂盒（30018.1）
• 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品避免含有二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇（BME）、EDTA、EGTA等化学成分
• 亲和液（Reagent B）建议保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，建议分装
• 亲和液（Reagent B）每次使用1毫升，可结合5至10毫克目标蛋白，回收率高达95％。用户可以根据需求，调整试剂用量
• 通常1升菌液（OD550=0.6），使用1毫升亲和液（Reagent B）即可
• 亲和液（Reagent B）可反复使用，使用－NTA金属亲和树脂再生试剂盒（30037）清除残余蛋白
• 如果用户需要透析处理，建议使用透析液（Reagent E）
• 建议使用BRADFORA定量方法（－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030）测定蛋白浓度
• 本公司提供系列融合蛋白处理试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定结合效果满意