通用型微型RNA（miRNA）定量扩增试剂盒

通用型微型RNA（miRNA）定量扩增试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

通用型微型RNA（miRNA）定量扩增试剂是一种旨在通过微型RNA分子的3’端Poly（A）加尾处理和通用型Oligo－dT适配体引物的使用，以及在逆转录酶（reverse transcriptase）的作用下把微型RNA逆转录成cDNA后，运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，既方便、快速地进行体外扩增（PCR法），又实时检测和定量分析扩增产物的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于特定微型RNA的表达、定量、基因拷贝数分析、RNA变异分析等。尤其可用于低拷贝量的微型RNA样品。产品即到即用，性能稳定，严格无核酶污染，逆转录效率和扩增产量皆高，定量准确，重复性好。

 

技术背景

 

成熟微型RNA（microRNA）分子是一种大小约21－23碱基的非编码单链小分子RNA。它由具有发夹结构的约70－90个碱基大小的单链RNA前体（PRECURSOR）经过DICER酶加工后生成。广泛存在于动物或植物等生物体细胞内，参与调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达。微型RNA表达具有时空和组织特异性，参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生。

 

产品内容

 

修饰液（Reagent A） 200微升

补充液（Reagent B）  10毫升

萃取液（Reagent C）   4毫升

浓缩液（Reagent D）   2毫升

沉淀液（Reagent E）  10毫升

净化液（Reagent F）  20毫升

引导液（Reagent G）  20微升

反应液（Reagent H） 200微升

扩增液（Reagent I） 600微升

引物R液（Reagent J）  20微升

荧光液（Reagent K） 500微升

内参液（Reagent L）  20微升

产品说明书   1份

 

保存方式

 

保存浓缩液（Reagent D）、沉淀液（Reagent E）和净化液（Reagent F）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，荧光液（Reagent K）避免光照，有效保证6月

 

 

 

用户自备

 

微型RNA样品：用于扩增的模板

特定PCR上游引物：用于扩增的特定微型RNA的启动分子

干式恒温仪：用于混匀物反应的孵育

PCR管：用于逆转录和PCR反应的容器

PCR扩增仪：用于核酸产物的扩增

1.5毫升离心管：用于微型RNA预处理的容器

4℃微型台式离心机（例如EPPENDORF5415R）：用于沉淀核酸

涡旋震荡仪：用于混匀反应物

 

实验步骤

 

• 微型RNA预处理

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂和用户自备的微型RNA样品置入冰槽里融化；同时将干式恒温仪设置到37℃。然后进行下列操作。

 

• 移取10微升用户自备的微型RNA（总量10微克）样品到预冷的1.5毫升离心管
• 加入10微升修饰液（Reagent A），混匀
• 放进37℃干式恒温仪孵育30分钟
• 放进冰槽里孵育1分钟
• 加入200微升补充液（Reagent B）
• 加入200微升萃取液（Reagent C）
• 涡旋震荡15秒
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心移出190微升上层液相溶液到新的1.5毫升离心管，留下20微升相位交界面的溶液
• 加入60微升浓缩液（Reagent D）
• 加入500微升沉淀液（Reagent E）
• 涡旋震荡15秒
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升净化液（Reagent F）
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液
• 空气中晾干（表面呈湿润状）
• 加入9微升补充液（Reagent B）
• 放进冰槽里溶解并等待后续操作

 

• 总微型RNA的cDNA合成

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂以及上述预处理的总微型RNA样品置入冰槽里融化；同时将干式恒温仪分别设置到42、60和95℃。然后进行下列操作。

 

• 分别将融化的试剂盒里的试剂溶液涡旋震荡2秒
• 放进4℃微型台式离心机离心5秒，速度为2000RPM
• 移取1微升引导液（Reagent G）到上述预处理的样品中，混匀
• 放进60℃干式恒温仪孵育5分钟
• 置于室温下孵育2分钟
• 加入10微升反应液（Reagent H），混匀
• 放进42℃干式恒温仪孵育60分钟
• 放进95℃干式恒温仪孵育5分钟
• 即刻放进冰槽里
• 加入80微升补充液（Reagent B）进行稀释
• 放进－20℃冰箱里备用

 

• 特定成熟微型RNA的cDNA扩增定量分析

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的扩增液（Reagent I），以及上述cDNA样品置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

• 移出30微升扩增液（Reagent I）到新的0.5毫升PCR管
• 加入1微升引物R液（Reagent J）
• 加入1微升用户自备的引物F液或内参液（Reagent L）
• 加入1微升上述稀释的cDNA合成物
• 加入2.5微升荧光液（Reagent K）
• 加入适量的补充液（Reagent B）到总量50微升
• （选择步骤）使用1000微升枪头加入2滴矿物油（注意：参见注意事项11）
• 放进PCR扩增仪
• PCR反应程序为：

 

温度（℃）	时间	循环
95	10分钟	1
95 59	15秒 60秒	35

 

• 采集数据，进行溶解曲线分析
• PCR产物置于－20℃保存，直到进行任何后续实验
• 移取5微升PCR产物进行3.5％琼脂糖凝胶电泳分析（阳性条带为50至100bp）

 

• （选择操作）初级微型RNA的cDNA扩增定量分析

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的扩增液（Reagent I），以及cDNA样品置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

• 移出30微升扩增液（Reagent I）到新的0.5毫升PCR管
• 加入1微升引物R液（Reagent J）
• 加入1微升用户自备的引物F液
• 加入1微升上述稀释的cDNA合成物
• 加入2.5微升荧光液（Reagent K）
• 加入适量的补充液（Reagent B）到总量50微升
• （选择步骤）使用1000微升枪头加入2滴矿物油（注意：参见注意事项11）
• 放进PCR扩增仪
• PCR反应程序为：

 

温度（℃）	时间	循环
95	10分钟	1
95 59 72	20秒 30秒 20秒	40
72	5分钟	1

 

• 采集数据，进行溶解曲线分析
• PCR产物置于－20℃保存，直到进行任何后续实验
• 移取5微升PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析（阳性条带为200bp以上）

 

注意事项

 

• 本产品为20次操作
• 适合各种荧光定量PCR仪
• 整个操作须在4℃条件下操作
• 整个操作须戴手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解RNA
• 建议所有的操作用品属于RNA专用
• －20℃冰箱里保存的试剂，避免反复冻融
• 模板RNA可以使用总RNA，但用量需1至20微克；如果使用纯化的微型RNA，用量可以5纳克至1微克
• 引导液（Reagent G）含有46碱基通用型Oligo－dT适配体引物
• 建议用户自备的微型RNA上游引物的设计，选择特定微型RNA分子的全部序列；如果Tm温度低于50，需对序列做些取舍
• 使用时，避免污染母液
• 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
• 配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性
• 通过调节Tm温度，达到PCR产物的单一性
• 成熟微型RNA的PCR产物大小在50至100碱基之间；微型RNA前体的PCR产物大小在100至200碱基之间；初级微型RNA的PCR产物大小在200碱基以上
• 内参液（Reagent L）为人体U6 snRNA（U6核内小RNA）上游引物（Tm为62℃），PCR产物为79碱基，作为比较分析时样品测SY量校正统一的参考标准
• 建议选用人体U6 snRNA或miR－16作为阳性对照，以此构建标准曲线：纵坐标（Y轴）为C_T值，横坐标（X轴）为已知细胞量（10，100，和1000细胞数）对数值或拷贝数或RNA量等，其有效用量作为样品检测量的标准
• 建议使用无模板作为阴性对照
• PCR扩增反应的Z初3个循环为定量基线；3至15个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为C_T值
• C_T值可以作为特定微型RNA表达的计量单位，也可以根据标准曲线转换为表达分子数进行计量
• 常用表达计算公式：2^－ΔCT，其中ΔC_T＝ C_T（特定微型RNA）－C_T（U6 snRNA）
• 本公司提供特定微型RNA分子扩增引物的设计和合成
• 本公司提供系列微型RNA技术产品

 

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定严格无核酶污染
• 本产品经鉴定定量准确