NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)

NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒
（Novoprotein目录号：NR001)

一、产品介绍：
NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)是近岸蛋白质科技ZX研发的专利产品。该
产品可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方
法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克
隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至20分钟，阳性率达到95%以上，让您轻松完
成实验。

二、使用方法：
A.线性化载体的获得

1、酶切
单酶切或双酶切皆可，并且5’端突出，3’端突出或平末端均适用本Kit。
2、PCR
建议用高保真的聚合酶扩增（推荐使用novoprotein pfu DNA 聚合酶，货号：E002）。

B.目的片段获得
目的片段通常通过PCR获得。引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与线性化载体的两端一致。

载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：
（1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5’端突出序列的同源序列；
（2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’端突出序列的同源序列。

C.目的片段与载体的重组
1.将目的DN**段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反应登录www.sinobio.net在线计算。
2. 混匀后在37℃放置20分钟;
3.立即进行转化，剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。

D.转化
我们建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5X106 cfu/μg.
1.冰上融化一管100 μl的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10μl的反
应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45分钟。
2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
3.加入500μl SOC液体培养基，37℃孵育45-60分钟。
4.5k离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定
建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用Novoprotein 2x specificTM Mater Mix 货号：E010)。