5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测

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百奥莱博专业生产销*(代"售")5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测
品Pai：百奥莱博
规格：20次
产地：国产|进口
编号：BTN131036
英文名：DNA 5´End-Labeling Kit
本产品为DNA 5´末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5´末端进行GX标记反应。原理如下：


产品特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5´末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使5´末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的5´末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能GX进行，均能得到大于106 cpm/pmol(5´-end)的比活性。

试剂盒组份：

 

成分	规格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交换反应缓冲液	100μl
10×磷酸缓冲液	50μl
Control DNA	20μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的5´磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5´末端)
5×交换反应缓冲液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

注：5 pmoles的5´末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。
3. 37℃反应30分钟。
4. 70℃加热5～10分钟使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7.离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用*酚抽提除去蛋白质时，请在第8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记

A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/*仿、3 M NaCl 、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
灭菌的超纯水	补足到150μL

3. 50℃反应30分钟。
4. 加入150μl的TE 饱和酚/*仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。
5.离心，取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(ZZ浓度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9.离心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反应(前反应)
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5´末端)
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的标记
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
Oligonucleotide DNA with free 5´-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。

注意事项：
1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2. 5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4. 当用于交换反应的DNA在5 pmoles以上(约1,000bp以上)时，标记效率有时会低于106 cpm/pmol。
5. 如果交换反应所用 DNA低于500bp时，标记效率有时会有所降低。
6. 若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5´末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反应时的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用举例：
按照使用方法中交换反应和合成DNA 寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示：


更多有关5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测的价格及使用说明等，请联*(代"系")我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：
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5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测关键词：5´末端同位素标记试剂盒,DNA 5´End-Labeling Kit,BTN131036


·嗜热菌蛋白酶
编号：BTN131028
英文名称：Thermolysin
规格：25mg
嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的金属蛋白酶。高消化温度可作为一种选择性的变性剂，促进抵抗蛋白水解的蛋白的消化。嗜热菌蛋白酶优先在疏水性的*基酸残基的N末端进行剪切，包括亮*酸、*丙*酸、缬*酸、异亮*酸、丙*酸和甲硫*酸。其ZJ消化温度范围在 65–85℃之间。嗜热菌蛋白酶活性的ZJpH值范围为5.0～8.5。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·Southern级真菌DNA提取试剂盒
编号：BTN130943
英文名称：Fungus DNA extraction kit(Southern Grade)
规格：10次
嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的金属蛋白酶。高消化温度可作为一种选择性的变性剂，促进抵抗蛋白水解的蛋白的消化。嗜热菌蛋白酶优先在疏水性的*基酸残基的N末端进行剪切，包括亮*酸、*丙*酸、缬*酸、异亮*酸、丙*酸和甲硫*酸。其ZJ消化温度范围在 65–85℃之间。嗜热菌蛋白酶活性的ZJpH值范围为5.0～8.5。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·通用型全基因组扩增试剂盒
编号：BTN100941
英文名称：Universal Whole Genome Amplification Kit
规格：30次
本产品是用于基因组DNA扩增全基因组的试剂盒，可以方便、简单、快速、经济的得到稳定产量的基因组DNA扩增样品。

产品特点：
1.基于phi29 DNA聚合酶的高保真性、高合成率和链取代能力。
2.可以扩增基因组达上万倍，具有高产量和高保真性的特点。
3.可使用各种来源的样品，包括全血，干血，发根，口腔粘膜刮液培养细胞，真菌和病毒等。
4. 操作简便快捷，恒温(30℃)反应，无须PCR仪即可实现扩增。
5.产物可用于多种后续试验，包括多重PCR、长片断PCR、定量PCR、克隆、文库构建、单倍型分析、测序、基因芯片分析、各种遗传分析(片段差异，微卫星差异，SNP，STR)等。

试剂盒组成：

成分	规格
WGA溶液A	75μl
WGA溶液B	30μl
dNTP(10mM)	20μl
BSA	10μl
超纯水	1ml
Phi 29 DNA聚合酶(10U/μL)	15μl
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
本产品适用于纯化好的基因组DNA。

1.在PCR塑料管中加入1μL纯化好的基因组DNA，用量在100pg-100ng之间。可以同时做一个不加DNA模板的阴性对照。
2.在PCR管中依次加入2.5μL WGA溶液A，1μL WGA溶液B，超纯水4.3μL，轻柔吹打混合均匀(现在PCR管中总体积为8.8μL)。
3. 95℃保温3～5分钟，室温短暂离心半分钟，然后冰上放置15分钟。
4. 然后依次向上述反应液中加入0.5μL dNTP，0.2μL BSA，0.5μL Phi 29 DNA聚合酶(10U/μL)，轻柔吹打混合均匀。
5. 30℃保温3-12小时。使用PCR仪进行30℃保温并打开热盖保温。如果采用30℃水浴，在样品管中加入30-50μL石蜡油以防水分蒸发，因为30℃长时间的水浴也能使水分蒸发到管壁，从而改变反应体系中各成分的浓度、降低WGA反应效率。如果模板DNA量比较高，WGA三小时即可检测到DNA扩增。
6. 65℃保温10分钟使phi29 DNA聚合酶灭活。注：由于phi29 DNA聚合酶有DNA外切活性，所以将其灭活以免干扰后续反应。
7. 立即取3μL WGA反应液进行电泳检测扩增效果。注意：WGA缓冲液中不含有甘油和电泳染料，所以需要先加上样缓冲液。
8.扩增的DNA可以用于后续试验或冰箱长期保存。


5´末端同位素标记试剂盒 探针标记及检测关键词：5´末端同位素标记试剂盒,DNA 5´End-Labeling Kit,BTN131036


·大肠杆菌DH10B电击感受态细胞
编号：BTN160901
英文名称：E.coli DH10B Electroporation-Competent Cell
规格：50μL×5
 本电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC 及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(无论真核生物还是原核生物的基因组DNA 都能被GX的转入DH10B中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZΔM15 标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL 赋予其链霉素抗性。DH10B电击感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建。本感受态细胞经特殊工艺制作，经 pUC19质粒检测，转化效率>1010cfu/μg。
 菌株基因型为：[F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1endA1 araD139 Δ(ara，leu)7697 galE15 galK λ- rpsL nupG。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC培养基等。

使用方法：
1. 将0.1 cm的电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的DH10B电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。(注：对于质粒，测定转化效率使用1μl 10 pg/μL的对照质粒pUC19；对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mM Tris HCl，pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100 ng/μL，体积不超过5μL/50μL感受态。)
3. 用 200μl 枪头(用刀切除0.5 cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.4 kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作)，将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5. 向电击杯中加入700μL 不含抗生素的无菌培养基 SOC.，混匀后转移到空EP 管中，37℃，200rpm 复苏60分钟。
6. 5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μL 涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。平板上(因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放 37℃培养至少13小时。

注意事项：
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物转化，转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液(10mM Tris HCl,pH7.5; 1mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μL。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。
8.转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少ZZ用于涂板的菌量。
9.电击感受态细胞保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

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