16s rDNA测序和宏基因组测序

1.宏基因组学（Metagenomics）以及宏基因组测序
宏基因组学（Metagenomics）也称为元基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科。自然界中约有99%的微生物是不能在实验室条件下进行纯化培养的。宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析。通过宏基因组测序，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围。
目前宏基因组测序可以分为环境微生物多样性检测和宏基因组de novo测序。其中环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物16S rDNA高变区/ITS 的PCR扩增产物进行高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性和分布规律。宏基因组de novo测序是指对环境样品中所有微生物基因组DNA片段化后进行高通量测序，然后进行序列组装和基因注释，获得部分不可纯培养微生物的基因组序列，分析该环境下所有微生物基因集信息。

2.16s rDNA测序
2.1 16s rDNA测序的原理
16s rDNA基因存在与所有细菌的基因组中，具有高度的保守性。该序列包含9个高变区和10个保守区，通过对某一段高变区序列进行PCR扩增后进行测序，得到1500bp左右的序列。其主要研究群落的物种组成、物种间的进化关系以及群落的多样性。下图为细菌的16s区域。


2.2 16s rDNA测序的技术路线

2.3 16s rDNA测序的样品要求
(1) 样品采集：由于环境条件的变化对微生物影响很大，因此要求样品采集条件保持高度一致。为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后立即冷冻保存。
(2) 样品DNA：环境因素异常复杂，许多物质或YZ因子会影响后续PCR、测序文库构建和序列测定，常规提取方法不一定合适，建议按公司要求采用专用试剂盒提取。基因组DNA浓度＞50 ng/μl，总量＞5 μg，OD 260/280在1.8-2.0之间，并确保电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整；基因组DNA完全无降解；提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随样品一起送样。
(3) 样品保存期间切忌反复冻融。
(4) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

2.4 16S rDNA测序结果分析
测序下机的数据经过处理后进行生物信息分析。1)对原始数据进行过滤，去除低质量数据，得到干净数据后进行后续分析；2）将Paired-end reads拼接为Tags,并且去冗余，获取Unique Tags；3）对Unique Tags 进行聚类，生成OUT；4）利用生成的OUT进行物种分类和统计，单样品复杂度分析，样品间复杂度分析，样品间显著差异分析等等。

3. 宏基因组 de novo测序
3.1  宏基因组 de novo测序原理
宏基因组测序是对环境样品全部微生物的总DNA进行高通量测序，主要研究微生物的种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协助关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯化培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为环境微生物群落的研究提供了有效工具。
其是将微生物基因组DNA随机打断成500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列。其可以在16S测序分析的基础上进行基因和功能层面的深入研究（GO，Pathway等）。

3.2 宏基因组测序技术路线

3.3 宏基因组 de novo测序样品要求
（1） 样品采集：采集条件的一致是最为重要的环节，需严格按照标准采样，采样后立即冷冻保存。
（2）样品DNA：环境因素异常复杂，许多物质或YZ因子会影响后续PCR、测序文库构建和序列测定，常规提取方法不一定适合，建议按公司要求采用专用试剂盒提取。基因组DNA浓度＞100 ng/μl，总量＞20 μg，OD 260/280在1.8-2.0之间，并确保电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整；基因组DNA完全无降解；提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随样品一起送样。
（3）样品保存期间切忌反复冻融。
（4）送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
3.4 宏基因组 de novo测序结果分析
测序下机的数据经过处理后进行生物信息分析。步骤如下：1）对原始数据进行过滤，去除低质量数据，得到干净数据（Clean Data）进行后续分析；2）通过比对去除源自宿主 DNA 的序列；3）对去除宿主 DNA 后的reads 进行序列组装，并对组装结果进行评估；4）从评估结果中挑选ZJ组装结果，分析物种的组成和丰度、预测基因 ORF 并进行注释分析。