真菌种属鉴定PCR Mix 6

真菌种属鉴定PCR Mix 6
(一)总RNA提取
取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中，按100g:3ml的比例加入Trizol试剂，严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。
(1)加Trizol（按3ml/100mg组织，宁多勿少）置于玻璃匀浆器中匀浆后，冰浴10-15min。
(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g离心10min。
(3)上清液移至另一EP管中，室温放置10-15min。
(4)加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，振荡15s，室温置5min。
(5)4ºC 12000g离心15min。
(6)仔细吸取上层水相，移至新的EP管中。
(7)加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，振摇，置室温10min。
(8)4ºC 12000g离心10min，EP管底部可见白色沉淀物。
(9)弃上清，纸巾吸干，加入75%乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
(10)4ºC 11000g离心5min。
(11)吸尽乙醇，空气干燥10min（可离心加快干燥，尽量吸尽离心液体）。
(12)半透明时将RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混匀），-20ºC冻存备用。
(13)所提取的总RNA用核酸蛋白分析仪分析RNA含量和纯度，所有标本260/280nm吸光度的比值均为1.8-2.0。
(14)取所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的28s和18s两条rRNA。
真菌种属鉴定PCR Mix 6
(二)逆转录反应
DEPC水 9ul
dig primer 1ul
5×buffer 4ul
10M dNTPmix 2ul
RNA酶YZ剂 1ul
总RNA 2ul 70ºC 5min
逆转录酶 1ul
20ul 42ºC 60min(+?)
70ºC 10min
4ºC ∞
(三)PCR反应
DEPC水（可用高压双蒸水） 17.5ul
10×Taq buffer 2.5ul
MgCl2 2.0ul
10M dNTP Mix 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
Tap酶(5u/ul) 0.5ul
总CDNA 1.0ul
25ul
PCR仪参数设置
94 ºC
5min 94 ºC ? ºC 72 ºC
30s 45s 45s 72ºC 4ºC
7min ∞
真菌种属鉴定PCR Mix 6
(四)电泳
(1)20ml 0.5×TBE
0.3-0.4g琼脂糖
煮沸，配成1.5-2.0%琼脂糖凝胶（RNA为1.0%）
(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室温冷切30min
(3)拔梳，加入4ulPCR产物+1ul上样缓冲液
(4)电压100-135V
(5)UVP成像系统观察
试剂配制
5×TBE配制方法（1L计）
Tris-Base 54g
硼酸 27.5g
EDTA 3.72g
加双蒸水至1L
2%琼脂糖凝胶配制方法
琼脂糖 0.4g
0.5×TBE 20ml
EB 4ul
方法的改进版：室温冷切10min，放至4ºC冰箱20min
相关技巧
1、注意反应体系的一致，可分装
2、先P内参，检验CDNA的完整性
3、首先考虑退火温度
4、注意引物的设计
5、若目的条带无法到达指定位置，可先或晚于MAKER电泳
6、通过加量或减量PCR产物来达到灰度的调整
7、必要时可行标本间替代
8、可设计相应大小的内参来达到ZZ目的
9、2度水浴箱的妙用

1. 必要时进行相关技术处理

真菌种属鉴定PCR Mix 6问题解答
无条带
反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。
DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。
退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
DNA模板量太少。增加DNA模板量。
引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
DNA模板中存在YZ剂。确保DNA模板干净
模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。
PCR产物量过少
退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
DNA模板量太少。增加DNA模板量。
PCR循环数不足。增加反应循环数。
引物量不足。增加体系中引物含量。
延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
DNA模板中存在YZ剂。确保DNA模板干净
有杂带
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
引物退火温度过低。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
外源DNA污染。确保操作的洁净。
真菌种属鉴定PCR Mix 6条带弥散
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
酶量过多。减少DNA聚合酶的使用量。
循环数过多。减少反应循环数至30.
引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
条带大小与理论不符
污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
模板或引物使用错误。更换引物和模板。
基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
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