人直肠腺癌细胞（中分化）

中文名称	人直肠腺癌细胞（中分化）
英文名称	HRC99
提供形式	P3-5代T25细胞培养瓶
种属	人
来源	直肠腺癌
培养基	1640
状态	贴壁

悬浮细胞如何传代？
方法一：
1.当细胞适合传代（即：处于对数生长期而未达到汇合状态）时，从培养箱中取出培养瓶，使用无菌吸管从培养瓶中取出少量细胞样品；如果吸取样品前细胞已经沉淀，应转动培养瓶，使细胞在培养基中均匀分布；
2.通过此样品，采用血球计数器或细胞计数仪测定总细胞数；计算将细胞稀释到推荐接种密度时需要加入的培养基体积；
3.在无菌状态下将适量预热的生长培养基加入到培养瓶中；必要时可将培养的细胞分到多个培养瓶中；
4.将培养瓶的瓶盖拧松一圈，以便进行充分的气体交换（或者使用透气性瓶盖），并将培养瓶恒温培养箱中静置培养（注：为了尽量减少细胞碎片和无用的代谢副产物在培养体系中蓄积，每周应将细胞悬液至少离心一次，离心力为200×g，时间为3-5分钟，然后用新鲜的生长培养基重新悬浮细胞沉淀）。
方法二：
1.将人直肠腺癌细胞（中分化）悬液转移到15mL无菌离心管中，以200×g离心力离心3-5分钟（请注意离心速度和时间依细胞种类不同而有所差异）；
2.用最少体积的预热完全生长培养基重新悬浮细胞沉淀，将细胞悬液按照推荐比例稀释，并将适量体积的细胞悬液转移到新的细胞培养容器中；
将培养瓶的瓶盖拧松一圈，以便进行充分的气体交换（或者使用透气性瓶盖），并将培养瓶恒温培养箱中静置培养。
贴壁细胞传代方法
1.从培养容器中吸出用过的细胞培养基并丢弃；
2.用不含钙、镁的平衡盐溶液冲洗细胞（每10cm2培养表面积约2mL溶液）；从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次（注：冲洗步骤可去除可能YZ解离剂作用的少量血清、钙和镁）；
3.从培养容器中吸出冲洗液并丢弃，向培养瓶中加入预热的解离剂；试剂量应足以覆盖细胞层(每10cm2大约0.5mL)；
4.轻轻摇晃容器，使试剂完全覆盖细胞层；吸出多余解离试剂，T25细胞培养瓶留200ul左右即可；
5.将培养容器在室温下孵育约2分钟（请注意实际孵育时间根据所用细胞系不同而有所差异）；
6.在显微镜下观察细胞解离情况；如果解离程度未达90%，可将孵育时间延长几分钟，每30秒钟检查一次解离情况；也可轻轻拍打培养容器以加快细胞解离；
7.细胞解离程度大于等于90%时，倾斜培养容器，使细胞上液体尽快流尽；加入所用解离剂两倍体积的预热完全生长培养基；吹打细胞层表面数次，使培养基分散；
8.将人直肠腺癌细胞（中分化）转移到15mL无菌离心管中，以200×g的离心力离心3-5分钟（请注意离心速度和时间依细胞种类不同而有所差异）；
9.用最少体积的预热完全生长培养基重新悬浮细胞沉淀，将细胞悬液按照推荐比例稀释，并将适量体积的细胞悬液转移到新的细胞培养容器中，把细胞放回培养箱（注：如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）。
人直肠腺癌细胞（中分化）如何快速适应无血清培养基？
<无血清培养基>
有许多细胞系是相对容易适应无血清培养基和无蛋白培养基的，而对环境变化相对敏感的其它细胞则难以适应变化，这就需要更为专业的方法来让细胞适应环境变化。
而根据细胞系的特性，有两种方法可使细胞适应无血清培养基。DY种方法是连续适应/循序隔绝法；另一种方法是直接适应。
一、连续适应/循序隔绝法
DY种方法是连续适应/循序隔绝法。通过一系列的血清还原步骤，使细胞适应无血清培养基。这是优先选用的方法，且不对细胞培养环境形成太过恶劣的变化。
续适应/循序隔绝法——方法1
使原培养基内的细胞连续地经过以下几个阶段：
阶段1：75%补加血清的培养基或25%无血清培养基
阶段2：50%补加血清的培养基或50%无血清培养基
阶段3：25%补加血清的培养基或75%无血清培养基
阶段4:100%无血清培养基
连续适应/循序隔绝法——方法2
1、以原培养基中的相同浓度，将血清加入无血清培养基内。将细胞从含血清的原培养基转移到加了血清的无血清培养基，此时应注意要提高新培养系统中的细胞密度。让细胞有一个适应过渡期。
2、按照方法1，缓慢地降低血清浓度，使细胞在每个阶段有适应的时间。
3、一旦血清补加量降为0，在用于进行分析或其他操作前，让细胞培养物具有数个适应过渡期。
二、直接适应法
另一种方法是直接适应。其中，细胞直接从含血清培养基转移到无血清培养基内。将大量细胞直接转移到无血清或无蛋白的新培养基内。细胞必须处于指数生长期中期，且存活率>90%。
每3到4天更换约50%的培养基，以防止培养基变成酸性。维持高于正常值的细胞培养密度，直至培养的细胞需要每日更换培养基。这时，将细胞扩增到多个培养瓶内。
考虑建议
在适应过程中，细胞通常对PH和温度变化较为敏感。让细胞在每个阶段都至少有一个适应过渡期。
细胞存活率和细胞密度
细胞在对数生长期中期快速分裂，且在适应过程开始时，存活率大于90%。这一点至关重要。当细胞需传代时，建议采用1:2或1:3的小传代比例，以维持更高的细胞密度，同时提供隔绝期间可能有助于细胞的细胞生长因子。
当细胞适应新的培养条件时，在增大细胞传代密度。
细胞生长
如果在适应过程中，细胞停止了生长，则需让细胞有更多的时间来适应培养基组合。例如，在方法1的阶段4，向无血清培养基添加少量的血清(1-3%)。这样有助于细胞更容易地适应新的培养基。然后，在几个过渡期内，缓慢地减少血清量，直至学清量为0。
悬浮培养物
一些公司的无血清培养基和无蛋白培养基不含血清中所发现的细胞贴壁因子。在一段过渡期内，贴壁细胞将开始离开表面，并成为悬浮细胞系开始生长。细胞也可能因适应而发生形态变化。监测细胞的生长速度，只要细胞能够与新系统相融合，任何形态变化都不重要。
细胞丛
在适应于无血清培养期间，细胞容易形成丛。传代培养时，将丛轻轻折断，使其分散开。将培养物从静止细胞培养瓶内转移到可旋转锥形瓶内，这样可能会有助于防止细胞丛的形成。
抗生素
由于血清蛋白易于粘合到抗生素上，因此，不建议在无血清适应过程中使用抗生素。如不存在血清蛋白，则抗生素水平可能会对细胞产生毒性。
预防措施
确保在开始适应过程前，储存有大量原培养基的细胞。如果细胞没有存活到下一阶段，则在整个过程中保存每一阶段使用的培养瓶。