》》细胞实验相关问题解答《《7、问：有没有人用5-氮-2脱氧胞苷干预细胞？哪个药是怎么配的？配好的溶液要怎么消毒？答：此药叫地西他宾，我用于白血病细胞侏上，配完了用滤器过滤。
8、实验设计的问题。问：流式细胞仪细胞自噬与细胞周期双参数分析：
(1)收获HeLa细胞5*105个；
(2)用4℃预冷的PBS洗2遍；
(3)然后用4%不含甲醇的甲醛冰上固定细胞15min；
(4)以PBS洗2次；
(5)80%冰乙醇固定，置-20℃冰箱过夜。固定细胞。
(6)用PBS洗两次；
(7)加入0.25%Triton-X100冰上放置5min；
(8)PBS洗2次；
(9)然后加入1%BSA处理30min，1200r/min离心5min，用1%的PBS100μl重悬细胞；
(10) 加入1%BSA稀释的兔抗人MAP1-LC3-Ⅱ(1:100)，4℃孵育过夜；
(11)再次日细胞用PBS洗3次后，加入FITC标记的羊抗兔IgG(1%BSA以1:100的比例稀释)，室温下避光孵育30min；
(12)PBS再次洗涤细胞后，用10μg/ml PI和0.1%RNase A室温下细胞核DNA染色30min，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析。
以上是我准备做流式的步骤请教各位高手对我的实验设计有什么看法？
请问：
(1)用Triton-X100对细胞破膜后对后面的用PI检测细胞周期有没有影响？
(2)由于想节省时间和经费我想在同一个样本(同一个流式管)中同时检测LC3蛋白和细胞周期不知道可不可行？
(3)我看到文献中FCM检测细胞凋亡率的方法(约1*106个各组细胞经质量浓度70%冷乙醇固定24h，PBS清洗，加1%RNase 37℃消30min。随后，用50μg/ml碘化丙啶(PI)(sigma 公司)4℃避光染色30min；流式细胞仪488nm激发波长测定细胞DNA含量。各组均测定10000个细胞，以DNA含量低于G1期的亚二倍体细胞(sub2G1细胞)为凋亡细胞。由流式细胞仪附带软件计算凋亡百分率。)
我看与我上面的方法差不多，我能不能同时检测一下细胞凋亡率？也就是说我的同一个细胞样本同时检测一个蛋白，一个细胞周期，一个细胞凋亡率这三个指标，不知道可不可行？
答：你的protocol，洗的次数太多，固定后的细胞比较脆弱，很容易弄破，用流式的方法检测细胞凋亡率，本身是有难度的，亚二倍体的峰与碎片峰很难区别。
9、问：如何检测呼吸爆发？有没有简便易行的办法？检测过氧化氢酶一般用什么方法？答：流式细胞术，DHR123染色。
10、流式细胞检测中怎样避免消化的单细胞再度聚集的问题：问：(1)我在试着做了一次流式细胞检测，先消化细胞(PBS+EDTA+EGTA)，然后立刻进行细胞计数，完毕后，发现消化的细胞又聚集在了一起(形成白色絮状物)，不知哪位也发现了类似的现象，应该怎样避免细胞再聚集？细胞的再度聚集是否和细胞长时间处于消化液中有关？
答：用枪多吹打几次，我做的时候也总是这样，怀疑是细胞太多了。
(2)在细胞计数后聚集、吹打，细胞数是不是不准确了？
答：不要消化太过，我是在50%细胞浮起后就轻轻拍打，燃后立刻终止消化，酶液加edta，建议新配，这样每次波动不大，心中有数。
11、如何去除死细胞的干扰问题：问：我打算用流式细胞仪测成年大鼠心肌细胞内钙，fluo-3 负载。由于我的成年大鼠心肌细胞是用酶灌注急性分离而来，大家都知道急性分离成年大鼠心肌细胞非常非常脆弱，正常存活率也就在70%左右，再进过处理因素折腾相信死得更多，在这情况下我用流式细胞仪测10000个细胞，岂不是其中包括相当量的死细胞，请问各位是怎么避免死细胞的干扰的？
答：你可以在上流式之前用PI或7-AAD染色，它们可以透过死细胞的细胞膜将细胞染色，而活细胞膜完整，不会染色。这样在流式细胞仪上就可以通过染色去除染色阳性的死细胞，只要阴性的那部分。这样计数活细胞就应该会比较准确。当然7-AAD会优于PI，因为PI的细胞毒性会更大，而且在流式上的图形也不会像7-AAD漂亮。可以试试。
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