聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。上海北京广州PCR技术服务,PCR代测
Real -Time PCR，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来，广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。
主要仪器及耗材
仪器名称
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厂家
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型号
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Real-time检测仪
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ABI公司
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ABI-7300
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低温冷冻离心机
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上海卢湘仪离心机仪器有限公司
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TG-16M
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移液枪
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吉尔森P型移液器公司
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P2、P10、P20、P100、P200、P1000
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旋涡振荡器
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青浦泸西仪器厂
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K30
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电动匀浆机
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FLUKO
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PRO200
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离心管及10μL、200μL、1000μL枪头等常规耗材均为国产；RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的DEPC水浸泡过夜，121℃灭菌30min，烘干后备用。
2 方法
2.1 组织总RNA的提取
（1）取组织或者细胞于1mL的Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上；
（2）置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min；
（3）吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的绿仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min；
（4）吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清；
（5）加入1mL75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清；
（6）加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min；
（7）加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。
2.2 cDNA一条链的合成
2.2.1 总RNA中DNA的消除
DNaseⅠ：
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1μL
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10×DNaseⅠ Buffer：
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1μL
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总RNA：
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≦1ng
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nμL
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总体积：
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10μL
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37℃，30min；Hold，加1μL的EDTA；65℃，10min。
2.2.2 反转录
（1）按以下体系加入：
RNA-Primer Mix：
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12μL
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5×RT Reaction
Buffer：
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5μL
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25mM dNTPs：
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1μL
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25U/μL RNase
Inhibitor ：
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1μL
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200U/μL M-MLV Rtase：
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1μL
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Oligo（dt）18
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1μL
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ddH2O(DNase-free)：
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4μL
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 总体积：
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25μL
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反应程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。
2.3 Real-time PCR扩增
将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：
SYBRGreen Mix 12.5μL
上游引物F 0.5μL
下游引物R 0.5μL
ddH2O 9.5μL
cDNA模板 2μL
总体积 25μL
反应程序：
95℃，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15
Sec；
60℃,1min；95℃,15
Sec；60℃,
15 Sec；、上海北京广州PCR技术服务,PCR代测
数据采用仪器自带软件分析:ABI
Prism 7300 SDS Software
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简介：RT-PCR（实时荧光定量PCR）实验服务
提供商：上海信帆生物科技有限公司
服务名称：RT-PCR（实时荧光定量PCR）实验服务
RT-PCR简介:
RT-PCR称为反转录PCR，实验步骤包括RNA提取、反转录、PCR和琼脂糖凝胶电泳，以软件分析电泳条带的灰度值（IOD值），通过与内参基因的灰度值比较，判断目的mRNA的相对表达量。
RT-PCR实验流程：
1.实验用品准备；
2.样本总RNA提取；
3.RNA浓度检测；
4.反转录；
5.数据分析及结论。
客户方提供：
细胞、组织、血液或cDNA样本。
提供结果：
电泳图片，分析结果及实验报告。
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