登革热病毒检测试剂

实验原理

DENV Detect IgM ELISA试剂盒是由一种酶联扩大的两步法免疫检测系统。在此实验中，将登革热阴性质控、阳性质控和未知浓度的血清样品用样品稀释液稀释，然后加入到包被 了抗人IgM抗体的微孔中温育，之后分别加入登革热源性重组抗原DENVRA和正常细胞抗原（NCA）进行温育。温育并洗板后，用HRP标记的DEN特异 性抗体处理。第二次温育并洗板后，加入TMB底物液进行温育。之后再加入酸性终止液，450nm处测OD值可确定底物反应的程度。当高于一定数值时（临界 值），样品的吸光度值可确定样品中是否存在登革热抗体。

注意：阴性质控和弱阳性质控以内在质控形式提供，其目的是为了监测试剂盒成分的完整性。

试剂盒成分

登革热IgM ELISA试剂盒提供了足够做96个测试所需要的试剂。试剂盒成分如下：

登革热检测特定材料：

1）抗人IgM包被的包被板：带板盖的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下储存，有效期内稳定。

2）样品稀释液：1瓶，25ml，即用，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，0.05%的Proclin防腐剂和添加剂，用于试验样品，阳性和阴性质控的稀释，2-8℃下储存，有效期内稳定

3）即用型的登革热重组性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.05%的Proclin防腐剂，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸盐），登革热重组抗原和添加剂， 2-8℃下储存，有效期内稳定。

4）即用型正常细胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.05%的Proclin防腐剂，COS-1细胞的上清， 2-8℃下储存，有效期内稳定。

5）登革热阴性质控：1支，50ul阴性血清，登革热阴性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定。

6）登革热IgM阳性质控：1支，50ul含0.03%的proclin的阳性血清，登革热阳性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定。

7）10倍浓缩洗涤液：1瓶，120ml，含吐温20的10倍浓缩的磷酸缓冲盐，2-8℃下储存，有效期内稳定。

8）HRP标记的即用型酶联物，1瓶，6ml，HRP标记的黄热病毒活性单克隆抗体，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，＜0.01%的硫柳汞防腐剂和添加剂，2-8℃下储存，有效期内稳定。

9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐温20的磷酸缓冲盐， 2-8℃下储存，有效期内稳定

10）            TMB底物液：1瓶，9ml液态底物液，即用，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：底物液必须始终储存于避光试剂瓶中。

11）            终止液：1瓶，内含6ml即用型的终止液，1N的硫酸，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：强酸，请戴保护手套、口罩和安全镜，按照安全条例处理所有的材料。

实验所需器材但试剂盒不提供

1）可在450nm处读数的酶标仪

2）生物学或高纯度水

3）真空泵

4）洗板机

5）37℃无CO2的孵箱

6）1-10ul的单道移液器，50-200ul的单道和多道移液器。

7）聚丙烯试管

8）Parafilm封口膜

9）计时器

10）            旋涡混合器

样品的采集与准备

1）此实验必须用血清来做。全血和血浆样本不能直接检测。

2）不要将不同批次的试剂混乱

3）不要加热热灭活的试验血清

4）实验前将所有试剂平衡至室温，温度的改变会对试验有影响

5）避免反复冻融样品血清

6）直接用干净的枪头从试剂瓶中移去试剂，不能转移，避免污染

7）不用的板条应立即放回至密封袋中保存

8）不要使用任何过期的试剂

9）避免试剂暴露受热或阳光直射

10）            有些试剂可能会产生沉淀，使用前一定要混匀

11）            洗涤过程不完整会对试验结果产生影响

12）            为了减少由于孵育时间的差异而引起的漂移，建议底物液和终止液加入的时间和速度要一致

13）            避免试剂中有微生物污染，尤其是酶联物

14）            每一次吸取试剂，标准品，质控品时都应用干净的枪头

实验步骤

将所有的试剂成分和样品都平衡至室温。实验前反复倒置以混合试剂和样品。

试剂准备：

1）1X洗涤液的配制：用生物学或高纯度水将10倍浓缩型的洗涤液稀释成1X的洗涤液。为了制备即用型的洗涤缓冲 液，我们可以将120ml 10倍浓缩的洗涤液加入到1080ml蒸馏水或去离子水中，冲洗掉所有晶体，旋涡混合溶液以至所有晶体都溶解掉。制备好的洗涤液可在室温下稳定储存6个 月。使用前请检查洗涤液是否被污染。

2）包被板的准备：将实验所需数目的板条置于板架上。将剩余的板条立即装入包装袋中，并储存于2-8℃的环境下，有效期内稳定。
操作步骤：

1）阳性质控、阴性质控都必须做双份检测,DENRA和NCA都要检测，未知血清样品可做一份或双份，DENRA和NCA都要检测，按照说明书上的操作流程图进行操作。

2）将实验中使用的板条标记好。

3）用试剂盒提供的样品稀释液将血清和质控品稀释100倍。用小聚丙烯试管进行稀释，稀释时至少需要4ul血清、阳性质控和阴性质控。如：4ul血清加396ul稀释液。

4）用单道或多道移液器将稀释好的血清、阴性质控和阳性质控各50ul加入到相应的微孔中。注意，所有的样品都必须用DENRA和NCA检测。

5）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。

注意：这样是为了保证温度的分布在每个孔的底部和边缘同等地散播。一旦顶部密封阻碍了蒸发，任何多余的封板胶必需被剪掉。

6）37℃下孵育1小时。注意：不要将微孔板叠放，必须单独地分层平辅。这对于温度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何气体，不要让板条接触任何湿润的物质，如湿纸巾等。

7）温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。

9）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）

10）            37℃下孵育1小时。（同步骤6）

11）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

12）            用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP标记的酶联物。

13）            用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）

14）            37℃下孵育1小时。（同步骤6）

15）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

16）            用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。

17）            室温下温育（无需盖板）5min。

18）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

19）            用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。

20）            室温避光温育10min。

21）            温育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul终止液，室温温育1min。

22）            温育后，450nm处测    OD值。

登革热IgM ELISA实验操作流程图：

羊抗人IgM包被的包被板

将1/100比例稀释好的阴性质控、阳性质控和血清各50ul加入到相应的微孔中

在每一微孔中加入50ul 即用型的DENRA和NCA

37℃下温育1h，温育后洗板6次,300ul/孔

在每一微孔中加入50ul HRP标记的酶联物

37℃下温育1h，温育后洗板6次

37℃下温育1h，温育后洗板6次

在每一微孔中加入75ul TMB底物液

室温避光温育10min

在每一微孔中加入50ul终止液

在每一微孔中加入150ul Enwash溶液，室温温育5min。之后用洗涤液洗板6次

酶标仪450nm处读取OD值

室温温育1min

 

质量控制

每一试剂中均含有阴性和阳性质控血清，这些质控可接受的免疫指数（ISR）值会在以下的详细表格中说明，阴性质控和阳性质控是用于监测试剂的实 质性错误，阳性质控并不保证试剂临界值的精确性。如果任一质控的ISR值不符合说明书，则本次实验是无效的必须重做，如果实验是无效的，病人的结果不能公 布。质量控制的执行必须与地方的，国家的或联盟规则要求和你实验的质量控制程序标准相一致，建议使用者参照NCCLS C24A和42CFR493、1256作为质量控制实践的指引。以下的结果仅作为例子。

阴性质控的计算：计算DENRA和NCA的登革热病毒阴性质控值。

例如：登革热阴性质控

                     DENRA          NCA

          No 1             0.108          0.066 

          No 2             0.082          0.061 

          总和             0.190          0.127

平均值（DENRA）= 0.190÷2 = 0.095

       （NCA） = 0.127 ÷ 2 = 0.064 

计算DENRA/NCA的比例： 0.095÷0.064 = 1.48

登革热阴性质控的计算DENRA/NCA比例高于1.65，则实验必须重做。

阳性质控的计算：计算NCA和DENRA的登革热IgM阳性质控。

例如：登革热阳性质控

DENVRA              NCA

         No 1            0.635             0.105

         No 2            0.655             0.115

         总和            1.290             0.220

平均值（DENVRA）= 1.290÷2 = 0.645

       （NCA） = 0.220 ÷ 2 = 0.110 

计算DENVRA/NCA的比例： 0.645÷0.110 = 5.86

登革热阴性质控的计算DENVRA/NCA比例低于5.0，则实验必须重做。

为了能出具实验报告，实验结果必须满足下列表格的要求。如果实验结果不能完全满足下列要求，则说明试剂退化了或者实验步骤出现了问题，实验必须重做。

表1：

结果计算:

ISR值的计算：如果样品是做双份检测，计算DENRA两个阴性质控的平均OD值，计算NCA两个阴性质控的平均OD值，并计算DENVRA/NCA的比率(ISR)。如果未知样品只做了一份，直接用DENVRA OD值除以NCA OD值

选择临界值和确定可疑范围：109个真阳性和97个真阴性样品用于优化ISR临界值，建立可疑范围。可疑范围由两个临界值决定，ISR≥2.84的为阳性，相应的特异性为99%，灵敏度为91%；ISR≤1.65的为阴性，相应的特异性为96%，灵敏度为94%，可疑范围为1.65-2.84.

结果说明

表2：:

期望值

疫区人群

此登革热IgM检测试剂盒在2009年被南美的一间诊所用于检测有登革热症状人群的血清样本.被筛查的66位个体在起初都有发烧的症状.样本中包含有初次和二次的感染.样本的反应关系见下面表3和表4.

表3：疫区人群患者的期望值

a:所有反应的样品都经PRNT验证

非疫区人群

2004年3月期间,从佛罗里达州, 德克萨斯州, 宾夕法尼亚州收集无登革热症状的200份血清样本.样本覆盖男女的不同年齡阶段.被筛选的血清反应性见下表4

表4：非疫区无登革热症状人体的期望值

               a:此样品经PRNT验证为登革热阳性

性能特征

世界卫生组织调研表

用于热带病和儿童登革热研究和培训的详细参考表由联合国国际儿童紧急基金会/联合国开发ZX/世界银行/世界卫生组织共同提供的.由提供血清样本的七间实验室共同出编制.

其中一张用登革热IgM ELISA检测试剂盒筛查实验的结果表是在波多黎各的病控ZX完成,具体见表5

表5：WHO参考样品的反应性

阳性率和阴性率制成表格形式，最差的情况就是，可疑样品对于阳性率来说是假阴性，而可疑样品对于阴性率来说却是假阳性。

阳性比率：(100/109) 91.7% (95% CI: 84.9-95.8%)

阴性比率：(90/97) 92.8% (95% CI: 85.6-96.7%)

临床研究

研究ZX1：

此研究采用了一系列具有登革热症状的血清样本.在规定的时期内收集预定所需的样本数.197位个体的血清均取自东南亚的一些实验室,各取双份 (1至2周内收集,共394份)经实验室证明感染有登革热的血清样本.所有的个体在实验室经不同的检测方法(包括,PCR, IgG滴定等)确定为阳性结果.

以上所获的样本均用PANBIO公司提供的登革热IgM ELISA试剂盒检测.以发烧持续天数作为函数的阴性和阳性结果具体如下表.

表6：研究ZX1的结果

注意：阳性率和阴性率制成表格形式，最差的情况就是，可疑样品对于阳性率来说是假阴性，而可疑样品对于阴性率来说却是假阳性。

研究ZX2：

究所采集的具有登革热症状的212个体样本均来自美国西部.2008-2009年度在规定的时期收集到预定所需的样本.其中大部分的样品来自加 勒比海和美国德克萨斯州和佛罗里达州.另外小部分的样品来自非洲和亚洲.检测的212份样本中,116份为阴性,67份为阳性,29份为可疑样本.可疑样 本按说明书的规定重测后,有13份为阴性,5份为阳性,11份仍为可疑样本.

由于样本量和样本的获取等各种原因,只有PRNT检测了其中11份可疑样本中的5份(其中3份为阳性),72份阳性样本中的70份(62份为阳 性). 另共有130份样本不是用PRNT筛查,而是在疾控ZX用CDC Dengue MAC ELISA检测,共有9份不确定,4份可疑.再用PRNT重测,其中9份不确定样本中有3份是阳性,4份可疑样本中有2份为阳性. PRNT and CDC MAC ELISA具体统计见表7b.其中CDC MAC ELISA的13份可疑或不确定样本由PRNT分类.

表7a：反应样品经PRNT验证的结果

表7b：反应样品经CDC MAC Elisa^a验证

a: CDC MAC中的13个样品仍为不确定或是可疑，ZZ经PRNT验证划分

阳性和阴性率的计算由PRNT和CDC MAC数据共同决定

阳性率：(63/75) 84.0% (95% CI: 73.9-90.8%)

阴性率：(121/137) 88.3% (95% CI: 81.8-92.8%)

此比率是PRNT和CDC MAC数据合并的结果，CDC MAC Elisa中的可疑或不确定的样品（n=13）ZZ经PRNT划分

研究ZX3：

登革热IgM Capture ELISA试剂盒特异性的评估在美国中西部的一间公共健康实验室完成.此项研究采用了289份有登革热症状样本(2005-2008年期间收集) (其中136位个体并发患有西尼罗河病毒, 甲型肝炎,乙型肝炎,HIV, 落矶山斑点热(RMSF), 军团病或莱姆病).所有的检测和诊断都在公共健康实验室内完成.所有的样本均采自没有爆发过登革热疫性的美国中西部.基于这种历史条件,因此所有个体均可 认为无登革热病毒携带者.

经过DY次的检测和可疑样本的重测,ZZ得到215份样本为阴性,22份仍为可疑.52份样本为阳性.74份(包括阳性的和可疑)样本均用PRNT重测过,发现ZZ的交叉反应的原因归咎于西尼罗河病毒.

表8：美国无疫情的样品检测结果

a:所有登革热PRNT检测到的阳性样品的滴定量较低，被认定为是西尼罗河阳性血清，表明可能与登革热PRNT发生了交叉反应

b:注意：所有的假阳性和大量的可疑样品仅仅是因为与西尼罗河阳性样品间的交叉反应

样本可能会依据个人病情而进一步细分，例如，西尼罗河病毒的阳性个体可能与登革热试剂盒发生了交叉反应，结果见下表

表9：上述疑似发生了交叉反应的样品检测结果

无其他疾病的阴性率：(100/101) 99.0% (95% CI: 94.1-100%)

除了西尼罗河病毒外地伴随疾病的阴性率：(35/35) 100% (95% CI: 88.2-100%)

西尼罗河病毒的阴性率：(80/136) 58.8% ((95% CI: 50.4-66.7%)

35位个体未患有登革热样本(其中5份患有落矶山斑点热(RMSF),2份患有军团病,2份患有莱姆病,8份患有HIV,2份甲型肝炎,5份患有乙型肝炎,11份患有丙型肝炎)经PANBIO登革热IgM

Capture ELISA检测试剂盒检测没有一份表现为阳性或可疑.

在136位个体未患有登革热样本但携带有西尼罗河病毒的样本中,80份为阴性,16份为可疑,40份为阳性.

研究ZX4

登革热IgM Capture ELISA试剂盒特异性的评估是在美国南部的一间健康ZX进行的.此次评估用了199份(从2004-2008期间收集)认为无登革热症状的样本.大部分 的病患有头痛或发烧的症状,其他都表现出神经系统方面的症状.初次检测,183份样本为阴性,10份为可疑,10可疑样本经重测后,其中有6份被检测为阳 性. 再重测一次,10份可疑样本均为阴性.

这199份样本进一步用疾控ZX用CDC Dengue IgM (MAC) ELISA检测试剂盒重测,分类为阳性,阴性,可疑,不可解释.ZZ发现有16份样本为无法解释样本. 这些可疑样本用PRNT测则为阴性.如下表如示,用CDC Dengue IgM ELISA试剂盒检测,总有1份样本可疑,1份阳性.

表10：无疫情区的登革热样品检测结果

阴性率：(191/197) 97.0% (95% CI: 93.4-98.7%)

研究ZX5：

此次探究性研究采用55位具有症状表现的个体样本(平均年龄在35.1年,样本收集于2009年)均来自南美登革热疫区.样本的2次访问收集是 在4-14天(平均9天)采集,样本均用登革热IgM Capture ELISA 检测试剂盒检测.可疑样本用同样的试剂盒重测.同时用PRNT方法验证第1次和第2次访问的人群.在第1次和第2次之间访问样本的PRNT 4倍增长值表明有39位个体当前具有登革热症状.

表11：DY次访问采集的无疫情区的样品检测结果a

a:阳性率：(13/39) 33.3% (95% CI: 20.6-49.1%)

 阴性率：(15/16) 93.8% (95% CI: 69.7-100%)

b:PRNT阳性且DY次和第二次收集的样品之间增加值大于4倍

c:PRNT阳性且DY次和第二次之间增加值小于4倍

第二次访问个体(4-14天)的血清样本的结果如下表所示,检测的灵敏度随第二次访问的时间间隔而增加.

表12：第二次访问采集的无疫情区的样品检测结果

a:阳性率：(31/39) 79.5% (95% CI: 64.2-89.5%) 

阴性率：(15/16) 93.8% (95% CI: 69.7-100%)

b:PRNT阳性且DY次和第二次之间增加值大于4倍

c:PRNT阳性且DY次和第二次之间增加值小于4倍

如“结果解释”部分提到的，可疑样品应进行重复检测，如果还是可疑样品则需送去认证测试

回收率研究

五天内在不同的三个地点,两个不同的操作者完成对登革热 IgM Capture ELISA检测试剂盒可重现性研究实验的评估.样本(包括质控)均同时采用三份检测.实验分别在佛罗里达州一间公共健康实验室, PANBIO,在一家实验室.此次研究实验采用4份血清样本(均按照相关规定稀释).包括一份阴性样本,一份刚低于可疑范围的样本,一份可疑样 本,一份阳性样本.血清样本的稀释均符合临床相关要求检测的浓度范围.具体结果见下表.

表13：PANBIO公司登革热试剂盒的再现性

所有值都用DENRA/NCA比值计算

Sx=标准划分，如wr是板间试验，DD不同天地试验，OO不同操作者的试验，SS不同地点的试验

CV=变异系数

交叉反应研究

用登革热 IgM Capture ELISA检测试剂盒检测带有几种疾病(见下表)的血清样本.样本均采用双份检测.检测得到阳性和可疑性的样本采用一式三份重测.用血小板减少中和反应检 测阳性样本是为了评估登革热病毒的可暴露性.明显的交叉反应只在西尼罗河病毒中观察到。

表14：交叉反应

a:筛查其他含有特异性IgM抗体的样品，与疟疾IgM抗体的交叉反应不能用PANBIO的登革热检测试剂盒评估

b:PRNT试验中，钩端螺旋体样品与登革热酶免试验发生反应，呈阳性（表格中不包括此结果，因为它不是真阳性样品）

除掉三份血清样品（一份西尼罗河阳性，一份乙脑阳性和一份钩端螺旋体阳性）的其他128份样品经PRNT验证后为阳性，24份筛查出的阳性或可疑样品经登革热ELISA重测后，有12份西尼罗河阳性样品，与西尼罗河的交叉反应率为50%。

干扰研究：

四种干扰物质对登革热酶免试验的影响。一份登革热阴性和四份登革热阳性样品根据弱阳性到强阳性依次排列。四种干扰物质为胆红素，甘油三酯，血红 蛋白，胆固醇。胆红素不会对试验产生影响，高浓度的甘油三酯对弱阳性血清有轻微影响，增大ISR值，血红蛋白的高浓度和低浓度都会降低ISR值，胆固醇的 重复研究可得出多个结果，结果显示胆固醇的两个浓度都会影响DENRA的OD值，下表是相对于参考样品，加入干扰物质后ISR值的改变率

	质控 ISR值	胆红素		甘油三酯		血红蛋白		胆固醇
		1mg/dL	2mg/dL	500 mg/dL	3000 mg/dL	1600 mg/dL	16000 mg/dL	300 mg/dL	500 mg/dL
阳性质控	20.84	16.4%	-1.0%	-1.7%	9.8%	-67.2%	-80.6%	21.8%	-1.9%
阴性质控	1.18	-1.0%	-4.8%	-0.4%	7.2%	-1.3%	3.7%	7.0%	29.4%
样品D	14.40	-0.9%	-2.6%	20.8%	31.6%	-43.5%	-62.6%	-10.8%	-17.3%
样品E	6.36	25.1%	8.4%	-19.4%	-28.6%	-59.8%	-69.6%	-49.5%	-5.1%
样品F	0.94	15.5%	0.1%	-7.5%	-12.9%	-0.1%	12.2%	4.0%	1.1%

 

 

技术参数：

 

质量控制

每一试剂中均含有阴性和阳性质控血清，这些质控可接受的免疫指数（ISR）值会在以下的详细表格中说明，阴性质控和阳性质控是用于监测试剂的实 质性错误，阳性质控并不保证试剂临界值的精确性。如果任一质控的ISR值不符合说明书，则本次实验是无效的必须重做，如果实验是无效的，病人的结果不能公 布。质量控制的执行必须与地方的，国家的或联盟规则要求和你实验的质量控制程序标准相一致，建议使用者参照NCCLS C24A和42CFR493、1256作为质量控制实践的指引。以下的结果仅作为例子。

阴性质控的计算：计算DENRA和NCA的登革热病毒阴性质控值。

例如：登革热阴性质控

                     DENRA          NCA

          No 1             0.108          0.066 

          No 2             0.082          0.061 

          总和             0.190          0.127

平均值（DENRA）= 0.190÷2 = 0.095

       （NCA） = 0.127 ÷ 2 = 0.064 

计算DENRA/NCA的比例： 0.095÷0.064 = 1.48

登革热阴性质控的计算DENRA/NCA比例高于1.65，则实验必须重做。

阳性质控的计算：计算NCA和DENRA的登革热IgM阳性质控。

例如：登革热阳性质控

DENVRA              NCA

         No 1            0.635             0.105

         No 2            0.655             0.115

         总和            1.290             0.220

平均值（DENVRA）= 1.290÷2 = 0.645

       （NCA） = 0.220 ÷ 2 = 0.110 

计算DENVRA/NCA的比例： 0.645÷0.110 = 5.86

登革热阴性质控的计算DENVRA/NCA比例低于5.0，则实验必须重做。

为了能出具实验报告，实验结果必须满足下列表格的要求。如果实验结果不能完全满足下列要求，则说明试剂退化了或者实验步骤出现了问题，实验必须重做。