RFT052 双色预染宽分子量蛋白质Marke

产地：国产|进口

品Pai：百奥莱博

编号：RFT052

英文名：Dual Color Prestained Broad Molecμlar Weight Protein Marker

规格：20T(100μl)

本产品包含10种纯化的预染蛋白质组成，分子量范围为10kD-170kD，其中70kD条带为红色，10kD条带为绿色，其余条带为蓝色，可以用于SDS-PAGE和Western Blot转膜时确定未知蛋白的分子量。







使用方法：

1、一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用。

2、-20℃取一管样品，彻底融化，上样量根据胶的厚度和梳子的宽度确定。一般说来，0.75mm×5mm(厚度×宽度)的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。

3、电泳结束后，可以直接在胶上观察结果。

4、预染蛋白Marker在不同的凝胶系统中迁移率会有不同，因此只能用来粗略估计目的蛋白的大小。如要精确确定蛋白的大小，请在同一凝胶系统中用非预染蛋白Marker来标定预染蛋白Marker的分子量。



储存条件：-20℃，有效期12个月。



我公司的双色预染宽分子量蛋白质Marker(10～170kD)，性价比高，货期短，送货上门，欢迎您来电咨询购买，另外，我公司还生产供应销售下列产品：



·低分子量蛋白Marker II(14.4～116KD)

编号：RFT048

英文名称：Low Molecμlar Weight Protein Marker II

规格：20T(100μl)

本产品包含7种已知分子量的标准蛋白质组成，分子量范围为14.4kD-116kD，可以用来判断 SDS-PAGE未知蛋白的分子量。本成品由于含有SDS，不适于非变性胶蛋白电泳(Native PAGE)。







使用说明：

1、一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用。

2、-20℃取一管样品，彻底融化，95℃处理5分钟后立即上样。

注：

a.一次热处理后，未用尽样品-20℃保存；下次使用时只要室温完全融化混匀后即可上样，可以不用再加热处理。然而，如出现带型缺失现象或样品聚集在分离胶上沿，可在Marker中加入终浓度为50mM的DTT，95℃处理5分钟后再上样。

b.上样量根据胶的厚度和梳子的宽度确定。一般说来，0.75mm×5mm(厚度×宽度)的加样孔上样5μl，其他规格梳子请适当调整上样量。

3、电泳结束后，染色，观察结果。

注：使用银染时，由于灵敏度高于考马斯亮蓝染色方法，可以适当降低Marker上样量。



储存条件：-20℃。





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·2×SYBR qPCR MasterMix

编号：RFT094

规格：1ml|5×1ml|20×1ml

本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR? Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。以50μl qPCR反应体系为例，每次使用25μl 2×MasterMix，1ml可做40次 50μl qPCR反应。



使用方法：

1、冰浴中彻底融化2×qMasterMix，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。

2、按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：

	50μl反应体系	20μl反应体系	终浓度
2×qPCR MasterMix	25μl	10μl	1×
上游引物 10μM	1μl	0.4μl	0.2μM
下游引物 10μM	1μl	0.4μl	0.2μM
ROX Slolution I or II(50×)	1μl or 不加	0.4μl or 不加	x
模板	×μl	xμl	10pg-100ng
水	补至50μl	补至20μl

3、快甩离心将反应液收集到管底。

4、检测片段大于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(三步法)：

步骤	温度	时间	循环数
初始变性	95℃	10min*	1
变性	95℃	15sec	40
退火	55℃	30sec
延伸	72℃	30sec

检测片段小于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(两步法)：

步骤	温度	时间	循环数
初始变性	95℃	10min*	1
变性	95℃	15 sec	40
退火和延伸	60℃	60 sec

注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过化学修饰封闭的，初始变性95℃ 10分钟是必须的，时间过短会降低酶的活性。



实验结果分析

反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。



注意事项

1、本制品中不含内参染料ROX，ROX染料单独供应。客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX内参染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

2、本制品含SYBR Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。

3、建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。

4、-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。

5、模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。

6、引物：

建议每条引物工作浓度200 nM～800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。

a.引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%；

b.扩增片段一般小于300bp，如可能请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低；

c.如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性；

d.请尽量选择Tm为65℃～67℃；

e.A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich(特别是3"端)。避开T/C(Polypyrimidine)或A/G(Polypurine)的连续结构；

f.避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3"末端避开有2个碱基以上的互补序列；

g.引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。

此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。

7、对照设计：

a.No template control(NTC)：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。

b.Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。



常见问题及处理：

问题	可能原因	推荐的解决方法
无扩增曲线且无扩增产物(凝胶电泳)	反应体系中有PCR反应YZ剂	更换或纯化模板DNA。
	引物设计不合理	重新设计、合成引物。
	逆转录产物体积过量	减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。
	加样错误或有试剂未加	检查是否加了所有的所需试剂。
	引物的降解	通过PAGE电泳检测引物完整性。
	退火温度不正确	优化退火温度。
无扩增曲线但有扩增产物(凝胶电泳)	qPCR仪设置不正确	检查dye selction，reference dye是否选择正确
	失效的荧光检测	荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。
	荧光PCR仪问题	参考qPCR仪器说明书
阴性对照(NTC)有扩增曲线
	反应体系中有污染	qPCR片段较小，极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析，解链温度和目的片段相同，凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。
	引物二聚体	进行溶解曲线分析，如果扩增曲线的解链温度小于80℃，凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。
		提高退火温度3℃。
PCR效率高于110%(斜率>-3.1)	有非特异性扩增	溶解曲线分析非特异性扩增；优化引物设计
PCR扩增效率低于90%(斜率<-3.6)	反应体系中有PCR反应YZ剂	更换或纯化模板DNA
	PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。	确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。
	引物设计	重新设计引物，避免扩增区域的DNA二级结构。
实时荧光曲线线性不好	模板DNA含量较低或过高	应调整样品的DNA浓度。
	模板DNA中含有YZPCR扩增反应的物质	对模板DNA进行纯化或更换模板。
	质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA，逆转录反应液中所含的物质可能YZPCR反应。	请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用品Pai质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。
CT值高于预期值	加入的模板量太少	适当增加模板量。
	样品被降解	检查样品的完整性。
	引物不合适	重新设计合成引物。
CT值低于预期值	加入了过多的模板	减少模板量。
	PCR产物太长	一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp
CT值的标准差>0.16	取样不准确	每种样品的反应混合液单独配制，充分混匀；
		qPCR之前要离心，管壁不要沾有反应液。
ΔRn值太小	PCR效率太低	优化PCR反应条件。
	目标模板数太低	增加模板量。
扩增曲线的荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状	ROX添加量太大	使请根据ROX使用方法和使用的PCR仪进行确定ROX的添加量。
	荧光校正错误	请联系PCR仪器工程师或参照PCR仪器的使用说明书，进行本底和荧光校正。
	PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分，荧光收集不能充分完成。	适当增加延伸时间。
	以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增，荧光收集量的误差会增大	应增加反应体积以满足PCR仪器标准。

储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期半年。





双色预染宽分子量蛋白质Marker(10～170kD)关键词：Dual Color Prestained Broad Molecμlar Weight Prote,双色预染宽分子量蛋白质Marker(10～170kD),RFT052



5-溴-6氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 Thymol 93863-88-8

乙酸钾缓冲液(0.1mol/L,pH3.6-5.6,无菌)   500ml

BTN130551 单细胞RNA扩增试剂盒 Single Cell RNA Amplification Kit

Rossman固定液   500ml

ARB11055 人苯丙氨酸(LPA)elisa检测 Human l-phenylalanine,lpa ELISA KIT

ARB12152 大鼠白介素17(IL-17)血清中含量检测 Rat interleukin 17,IL-17 ELISA KIT

F040305 猪IgG抗原 Pig IgG

ARB10679 人血管假血友病因子(vWF)elisa测定使用说明书 Human von willebrand factor,vwf ELISA KIT

BFD059 磺胺类快速检测卡

β-葡萄糖苷酸酶 Sepharose 4FF 9001-45-0

6409-77-4 核固红 Nuclear fast red

PY02-155  胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)  250克  

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