腺相关病毒（AAV）包装
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腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因ZL载体之一。
AAV基因组及其编码的蛋白
1）rAAV侵染细胞过程
纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发受体介导的AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体（Endosome）、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。
腺相关病毒作用机制
2）AAV特点
1、 安全性高、免疫原性低：AAV是一种复制缺陷型DNA病毒，无自主复制能力，野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合，rAAV不整合。目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道，也是FDA批准上市的基因ZL药物中最安全的病毒载体之一。
2、 宿主细胞范围广：AAV具有广泛的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
3、 扩散能力强：AAV直径约20-26nm，体积小，滴度高，具有良好的扩散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。
4、 体内表达基因时间长：AAV具有保持长期基因转录表达能力，体内表达一般3周可以达到高峰，随后持续表达，作用时间＞5个月。
5、 载体容量小： 由于AAV的体积小，其是实验室常见病毒载体系统中装载量最小的。AAV的两个ITR之间所能容纳的ZD序列长度是4.7 kb。
6、 种类多样：AAV血清型众多，此外，根据不同的实验设计，我们还在不断的突变，筛选新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。
现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力，同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性（不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性），表现出一定的器官靶向特异性（表1）。
表1 不同血清型AAV的组织嗜亲性
| 血清型 | 组织亲和性 |
| rAAV2/1 | 神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌 |
| rAAV2/2 | 神经系统，肌肉，肝脏，血管平滑肌，眼 |
| rAAV2/3 | 肌肉，肝脏，肺，眼 |
| rAAV2/4 | 神经系统，肌肉，眼，脑 |
| rAAV2/5 | 神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜关节 |
| rAAV2/6 | 神经系统，肺，肌肉，心脏 |
| rAAV2/7 | 肌肉，肝脏 |
| rAAV2/8 | 神经系统，肝脏，，视网膜，脂肪组织 |
| rAAV2/9 | 神经系统，心肌，肺，视网膜，皮肤，肌肉，脂肪组织 |
| rAAV2-retro | 神经系统（逆向非跨突触） |
| AAV-PHP.eB | 跨血脑屏障（静脉注射） |
| AAV-PHP.S | 全外周神经（尾静脉注射） |
| AAV-PAN | （腹腔注射） |
| AAV-LUNG | 肺（尾静脉注射） |
| AAV-DJ | 视网膜，肺，肾脏，体外感染细胞 |
| AAV-7m8 | 视网膜 |
| AAV-ShH10Y | 视网膜Muller细胞 |
| AAV-Rh10 | 肝脏，血液，心脏，体外感染细胞 |
| AAV-Anc80L65 | 内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏 |
| AAV-SCH9 | SVZ区神经干细胞 |
小建议：如您不确定选择哪种血清型，可尝试使用和元上海Pandora’s Virus （AAVSY装）进行预实验，通过比较不同血清型对目标组织的感染效果，摸索ZJ实验条件（注射方法、注射位点、病毒用量等），以便得到更理想的实验结果。
基于上述特点，AAV被视为是一种GX和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中，与其他常用病毒工具载体相比，AAV具有感染过程温和长效的表达能力，而成为基因操作的利器（表2）。
| 慢病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒 | 逆转录病毒 | |
| 包膜 | 有 | 无 | 有 | 有 |
| 颗粒直径 | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm | ~100nm |
| 基因组 | dsRNA | ssDNA | dsDNA | RNA |
| 插入目的片段大小 | 4kb左右 | 2.8kb左右 | 6kb左右 | 1kb左右 |
| 外源基因表达时间 | 2-4天开始表达，长时间稳定表达 | 7-14天开始表达 | 1-2天开始表达，作用时间2周左右 | 2-3天开始表达 |
| 体内扩散能力 | 一般 | 强 | 强 | 一般 |
| 免疫原性 | 中等 | 极低 | 强 | 中等 |
| 滴度范围 | 108~109TU/mL | 1012-1013VG/mL | 1010-1011PFU/mL | 107~108TU/mL |
| 滴度检测方法 | qPCR整合DNA | qPCR非整合DNA | 抗原抗体免疫染色试剂盒 | qPCR整合DNA |
| 整合方式 | 随机高频整合 | 定向低频整合（rAAV不整合） | 非整合 | 随机整合 |
| 应用范围 | 体外细胞感染，gRNA文库筛选，体内 | 基于不同的血清型，体内广泛应用 | 嗜肝，快速表达或短期表达，血液、心脏，细胞系等 | 特异性只感染分裂期的细胞 |
3）AAV应用案例
3.1 广谱及特异性表达
3.1.1 广谱启动子
客户发表文章：EMBO Rep. (IF= 8.749). Li XG,et.al. (2019). Tau accumulation triggers STAT1-dependent memory deficits by suppressing NMDA receptor expression. [腺相关病毒, AD, 过表达，干扰]
注射部位：小鼠海马CA3区
载体：AAV-CMV-Y701F-STAT1-RFP&AAV-CMV-hTau-EGFP
病毒滴度：5 × 1012 VG/mL&1.13 × 1013 VG/mL
观察时间：1个月
3.1.2 特异启动子
客户发表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Li YD,et.al. (2017). A distinct entorhinal cortex to hippo-campal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. [腺相关病毒, 学习与记忆, 光遗传]
注射部位：小鼠LEC区
载体：AAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFP
病毒滴度：2× 1012 VG/mL
观察时间：1个月
3.2 在神经科学领域中的应用
3.2.1 外侧缰核&光遗传学
客户发表文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]
注射部位：小鼠LHb
载体：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29× 1012 VG/mL
注射体积：100nl
观察时间：1个月
3.2.2 臂旁核&化学遗传学
客户发表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]
注射部位：小鼠PBN
载体：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL
注射体积：150nl
观察时间：3周
3.2.3 丘脑&钙离子成像
客户发表文章：客户发表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]
注射部位：小鼠PVT
载体：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射体积：100nl
观察时间：4周
3.2.4 丘脑室旁核&杀死神经元
客户发表文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]
注射部位：小鼠PVT
载体：AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射体积：两支病毒1:1混合注射100nl
观察时间：4周
3.2.5 海马、皮层&逆向非跨突触（rAAV2-retro）
客户发表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相关病毒, 焦虑症, 光遗传]
注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
载体：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射体积：300nl
观察时间：4周
3.2.6 边缘前皮质&跨突触示踪（WGA-Cre）
客户发表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]
注射部位：小鼠PrL
载体：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度：4.28 × 1012 VG/mL
注射体积：300nl
观察时间：4周
3.2.7 全脑表达&跨血脑屏障（AAV-PHP.eB）
注射方式：尾静脉注射
载体：pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG& pAAV-CMV-mNeonGreen-3FLAG
血清型：AAV-PHP.eB
病毒滴度：1.10×1013 VG/mL&2.35×1013 VG/mL
注射体积：200nl（注射病毒总量：1.5×1013 VG）
观察时间：3周
3.3. 在视网膜中的应用
3.4. 在肝脏中的应用
客户文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶体，腺相关病毒过表达]
注射方式：尾静脉
载体：AAV8-TGB-Fabp1
血清型：rAAV2/8
注射体积： 200nl（病毒总量5×1011 VG）
观察时间：1周
3.5. 在肺部中的应用
和元AAV-LUNG感染肺部结果
3.6. 在中的应用
和元上海AAV-PAN感染结果
rAAV2/retro感染小鼠脑
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