环状RNA测序

技术简介

环状RNA(circular RNA，circRNA)是ZX发现的一类新型非编码RNA分子，其在真核细胞中的大量存在颠覆了传统的线性RNA观点，成为近两年来RNA领域中迅速升起的一颗新星。环状RNA的表达具有组织和疾病特异性，与组织发育、疾病的发SF展密切相关。此外，环状RNA不易降解，能在血浆、唾液等体液中稳定存在，可以作为新型疾病分子标志物。当前，科研人员对这一功能性分子仍知之甚少，可见对其展开全面深入的研究势在必行，一场科研的竞赛已悄然开始!

云序生物提供的环状RNA测序服务，采用Cloudseq CircRNA Enrichment Kit，GX去除样本中的线性mRNA和rRNA，保留纯化后的环状RNA，因此测序获得的环状RNA有效数据量是其他测序服务供应商远远无法企及的，帮助客户以ZD的成本检测到更多的环状RNA。此外，Cloudseq CircRNA Enrichment Kit覆盖几乎所有已知物种，对环状RNA的研究将不再局限于人、小鼠、大鼠等常见物种。

云序优势

适用于任何物种：

可以检测几乎任何动植物的环状RNA。

适用于降解样品：

可以检测部分降解的样品的环状RNA。

有效数据量高：

通过商业化kit富集环状RNA，极大地提高了有效数据比例。

性价比高：

能够以较低的成本检测更多的环状RNA。

一站式服务：

客户只需提供细胞、组织、体液或总RNA，云序生物为您完成从样品准备、文库制备、上机测序到数据分析的整套服务流程。

专业化的生物信息学分析：

云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求。

样本要求

样品类型：

组织、细胞、体液或总RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

a)细胞：2×10⁷

b)组织：100 mg

c)体液：全血、血清、血浆 2-3 ml

脑脊液：5 ml

尿液：50 ml

d)总RNA：2 μg  (OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5 无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾 )

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存;血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素;RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析

1、环状RNA的识别与注释

通过环状RNA高通量测序，采用严谨的生物信息分析学流程识别鉴定环状RNA，并根据他们在基因组上位置和数据库中来源进行注释。云序生物整合了来自文献、数据库的多个物种的环状RNAs，构成目前世界上最全的环状RNA数据库circDB，对环状RNA的来源进行了注释，并展示了环状RNA与疾病的关系，以节省耗时的文献查找和阅读。

2、差异环状RNA的筛选

按照预设的筛选标准(Fold Change≥2， P值≤ 0.05)筛选出差异表达的环状RNA。

注：Fold Change代表差异倍数，P值代表差异显著性，筛选中采用的倍数变化会根据具体数据情况进行调整

3、差异环状RNA的聚类

4、差异环状RNA的来源基因的GO和信号通路分析

对差异环状RNA的来源基因进行功能和信号通路富集分析，以便推断环状RNA的功能。

5、环状RNA-miRNA相互作用网络

通过环状RNA-miRNA相互作用网络分析，可以帮助解析作为miRNA海绵发挥作用的环状RNA的功能以及作用机制。

6、环状RNA的可视化

图形化展示了环状RNA在基因组中的分布，以及与之相应的线性RNA的位置关系。

案例解析

案例1：环状RNA具有miRNA海绵功能

原文：Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency

期刊：Nature 影响因子：41.58

本文通过环状RNA测序在人和线虫中发现了大量环状RNA，其中环状RNA CDR1as在人和小鼠中是保守的；此外，通过生物信息学分析。在CDR1as序列上找到了大量miR-7结合位点，进一步的功能实验表明：CDR1as通过作为miRNA海绵吸附miR-7，在斑马鱼脑发育中发挥重要的调控作用。

                                                             图1.  人类细胞系和线虫中检测到的环状RNA的数目和类别 

　　图2. CDR1as在不同物种中具有保守的miR-7结合位点

案例2：环状RNA功能具有结合调控蛋白功能

原文：Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency

期刊：Nature 影响因子：41.58

已有证据表明：CircRNA还可以通过结合蛋白分子，影响蛋白的定位和功能来发挥调控作用。CircRNA可以作为支架分子与多种蛋白结合;还可以通过序列互补与靶RNA/DNA结合，进而招募蛋白分子形成多分子复合物。

　　图3. CDR1as可以与AGO蛋白结合

案例3：人类癌症环状RNA表达谱研究

原文：CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification

期刊：Genome Biology 影响因子：13.21 

本文通过环状RNA测序和严谨的生物信息学分析，在15种人类细胞系中鉴定出了近10万种环状RNA，其中绝大多数是新发现的。这些环状RNA的表达呈现出很强的细胞特异性，并在不同类型的癌症中表现出极大的表达差异。此外，相对于线性RNA，环状RNA更加稳定。这些现象都表明：环状RNA具有作为新型肿瘤标志物的潜力。

图4. 不同类型环状RNA在不同细胞系中所占的比例