代理赛分ProAqa抗体亲和分析色谱柱及小规模制备柱

ProAqa亲和色谱柱是设计用于HPLC和FPLC系统的高流速高压色谱柱。其固定相采用平均粒径为20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯（PS/DVB）为基质，表面键合一层亲水涂层，涂层上以化学键合的方式连接了蛋白质A，蛋白质A可结合除IgG3之外的含Fc片段的免疫球蛋白。该色谱柱可用于抗体和融合蛋白（可特异性结合重组蛋白A）的定量和小规模纯化。

Figure 1.抗体样品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲线(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。流动相：磷酸钠缓冲溶液，0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321；流速：2.0 mL/min；检测波长：280nm

空白运行

    必须使用高纯度的缓冲盐，并在使用前过滤(0.22 or 0.45 μm)所有的缓冲溶液。

    上样前，必须执行空白运行，并监测本底。为了减小结合和洗脱缓冲溶液之间变化产生的基线变化，建议使用：     

(a) 50 mM磷酸盐 pH 7, 0.15 M NaCl 作为起始/淋洗缓冲溶液，以及 

(b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作为洗脱缓冲液。

    以上是有效的淋洗/洗脱系统，产生的基线波动Z小。如果要求洗脱样品保留生物活性，不建议使用盐酸(HCl)，因为盐酸会使抗体变性。

样品的准备和上样

    为了确保样品的有效结合和避免色谱柱筛板被污染，一般按照以下方式来准备样品：

(a) 将样品溶解到或溶剂替换为起始/淋洗缓冲液，这对于大体积样品尤为重要(超过25%的柱体积)。

(b) 进样前离心或过滤样品 (0.22 或0.45 μm)。

(c) 对血清样品进行热处理（置于56 °C 下30分钟）以去除会堵塞色谱柱的纤维蛋白原。

(d) 对样品进行去脂处理，因为脂类会对色谱柱产生不可逆的污染。

(e) 所有样品使用前应该用0.45 μm或0.2 μm滤膜过滤。

    为了确保样品的有效结合和避免填料与色谱柱被污染，需要对样品载量进行测定： 

(a) ProAqa 动态结合载量见“描述”。

(b) 其它抗体的结合载量取决于抗体来源与所属子类以及所使用的配体。但是一般会低于“描述”中IgG的载量。

(c) 当作为分析用途时，可通过标准线性曲线测定Z小和Z大上样量。

起始/淋洗缓冲液

(a) 绝大多数情况下，使用简单的缓冲盐如10 ~ 50 mM 磷酸盐或Tris。

(b) 起始/淋洗缓冲液的pH范围可在6.0到9.0之间，但需注意当pHZ高的时候结合力强。

(c) 加入一些盐 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特异性吸附。

洗脱条件

    如果色谱柱作为分析用途，洗脱缓冲液为含25-100 mM 磷酸盐，pH为 2.0-3.5，含0-150 mM氯化钠的溶液。其它可能会用到的洗脱缓冲盐组分包括盐酸、甘氨酸、柠檬酸、乙酸或其它可调低pH的组分。

    如果色谱柱作为制备用途，可采用以下条件。 

(a) 对于绝大多数抗体的洗脱，可将pH降至2-3，常用缓冲体系包括磷酸盐、乙酸盐、盐酸和甘氨酸。根据缓冲体系的不同，缓冲盐浓度为6-100 mM或2-20% (v/v)。

(b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl来获得理想的pH范围，并将基线波动降到Z低程度。 

(c) 由于抗体会因其种类和所属子类的不同而表现出不同的结合/洗脱行为，合适的洗脱条件需要通过经验性地测定。

例1 单克隆抗体在ProAqa色谱柱上的洗脱