大鼠神经纤毛蛋白1检测试剂盒

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泉州睿信生物核心专长：

生物药物分析方法开发

分析方法验证

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA 结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的 RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 RNA 进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的 RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的 RNA 序列可通过 microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR 或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现 miRNA 的调节靶点。

RIP 实验流程

（一）. 细胞裂解液获取

A. 单层细胞或者贴壁细胞处理

1.冷 PBS 清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

2.加入冷 PBS 后用细胞刮将细胞刮下来，收集至 enpendoff管

3.1500rpm，4℃离心 5min，弃上清，收集细胞

4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min

5.每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃

B.悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解

C.组织样品处理

1.冷 PBS 清洗新鲜切下的组织三次

2.加入冷 PBS 后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数

3.1500rpm，4℃离心5min弃上清，收集细胞

4用与细胞等体积的 RIP 裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min

5. 每管分装 200ul 细胞裂解液，贮存于-80℃

（二）. 磁珠的准备

A.实验前准备

1、enpendoff 管

2、磁力架

3、冰盒， RIP Wash Buffer 置于冰上

4、抗体，置于冰上

5、涡旋震荡器

6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水

B. 磁珠准备过程

1. 重悬磁珠

2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照

3. 吸取 50ul 重悬后的磁珠悬液于每个 enpendoff 管

4. 每管加入 500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡

5.将 enpendoff 管置于磁力架上，并左右转动 15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一 次

6.用 100ul 的 RIP Wash Buffer 重悬磁珠，加入约 5ug 相应抗体于每个样品中

7. 室温孵育 30min

8. 将 enpendoff 管置于磁力架上，弃上清

9. 加入 500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次

10. 加入 500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上

（三）. RNA 结合蛋白免疫沉淀

A. 准备工作

1、冰盒

2、360°旋转仪

3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上 B. RNA 结合蛋白免疫沉淀实验过程

1.准备 RIP Immunoprecipitation Buffer

2.将前上步的 enpendoff 管放磁力架上，去上清，每管加入 900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解冻一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心 10min。吸取 100ul 上清液于 上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为 1ml

4. 4℃孵育 3h 至过夜

5. 短暂离心，将 enpendoff 管放在磁力架上，弃上清

6. 加入 500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将 enpendoff 管放在磁力架上，弃上清，重复 清洗 6 次

（四）. RNA 纯化

A. 实验前准备

1.枪、枪头、enpendoff 管紫外照射 30min，喷DEPC水以除RNA 酶

2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free 的乙醇、异戊醇

4.DEPC 水置于冰上

5. 离心机预冷

6. 冰盒

B. RNA 纯化过程

1.准备 Proteinase K Buffer。每个样品需 150ul

2.用 150ul Proteinase K Buffer 重悬上述磁珠-抗体复合物

3.55℃孵育30min

4.孵育完之后，将 enpendoff 管置于磁力架上，将上清液吸入一新的 enpendoff 管中

5.于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer

6.于每管加入400ul苯酚：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

7.小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的 enpendoff 管

8.于每管加入400ul，涡旋震荡 15s，室温下 14,000rpm 离心 10min

9.小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的 enpendoff 管

10.每管加入 50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇(无 RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜

11.14,000rpm，4℃离心 30min，小心去上清

12.用 80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心 15min，小心去上清，空气中晾干.

13.10-20ulDEPC水溶解，-80℃保存，送测序或进行下游实验。

 大鼠神经纤毛蛋白1检测试剂盒

服务目的：

测定两种目的蛋白质是否在细胞内结合；也可用于测定确定某种特定蛋白质的新的作用 搭档。

服务原理：

以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，当细胞 在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质 x 的抗体免疫沉淀 x，那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也能沉淀 下来。 服务材料：

试剂：蛋白提取试剂盒、非离子变性剂（NP-40、TritonX-100）、PBS、TBS、相应的 IgG、Protein A 或 Protein G 琼脂糖凝胶珠、SDS-PAGE 电泳、上样缓冲液。

仪器：振荡器、蛋白电泳仪、恒温箱、脱色摇床。

服务流程：

1）用其特定蛋白的抗体与 ProteinA/G 相结合(Flag IP Kit 已结合上)；

2）用抗体成点特定蛋白，特定蛋白已结合了与其相互作用蛋白；

3）通过洗涤得到纯复合蛋白后用感兴趣蛋白抗体通过 WB 方法检测其 IP 结果；

4）提交 WB 图与分析结果和实验报告。

服务方法：

1、蛋白样品准备。收集细胞或组织，在非变性条件下裂解细胞，释放蛋白。

2、选做去除非特异性结合。取待测样品，选用和免疫共沉淀时使用的 IgG 种属相同的 普通 IgG 与琼脂糖凝胶珠混合，4 oC 慢摇 30min-2h。离心取上清。

3、免疫共沉淀。加一抗，4 oC 慢摇过夜。加琼脂糖凝胶珠，4 oC 慢摇 1~3h。瞬时离心 弃上清。PBS 洗沉淀 5 次。

4、加电泳上样缓冲液，煮沸用于 SDS-PAGE 电泳。

技术优势

1、灵敏度高，无内源性干扰；

2、检测范围宽，大于 7 个数量级；

3、检测速度快，样品无需孵育等预处理；

4、操作简便，可以在同一管内完成 2 个荧光素酶检测。

服务内容

1、构建荧光素酶载体（或客户自备载体）；

2、细胞培养与转染；

3、荧光素酶检测；

4、数据分析。

我们提供原始实验数据、实验报告质量保证GX转染试剂、高灵敏度荧光素酶检测试剂盒，确保结果的可靠性

服务原理：

在细胞生物学研究中，有些靶蛋白表达水平不高，难以用免疫印迹的方法检测到。 为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀，纯化和富集靶抗原。

免疫沉淀是指可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的情况下，按适当比例混合而成 可见沉淀物的现象。免疫沉淀技术是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合或细菌蛋白质 的“protein A”特异性的结合到免疫球蛋白的 Fc 片段的现象开发出来的方法。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是细胞裂解液 中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱、收集免疫复合物，然后进行 SDS-PAGE 及 Western blot 分析。

服务流程：

细胞或组织裂解---裂解液预清除---蛋白及抗体反应----复合物及珠子交联----蛋白及珠子分离----收集蛋白，WB分析

客户提供： 1.细胞或组织。 2.目的蛋白信息。 3.目的蛋白抗体。

交付结果： 1.免疫沉淀蛋白样品。 2.WB 电子分析报告。

产品定义

PRM（平行反应监视，parallel reaction monitoring）是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段进行定量。

技术原理

PRM技术基于高分辨、高精度质谱（如Orbitrap系列），首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中（Q1）选择性地检测目标肽段的母离子信息；随后在collision cell中对母离子进行碎裂；后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

相比于传统的SRM/MRM技术，PRM技术将采集二级信息所用的四级杆质量分析器替换为更高分辨、更高质量精度的分析器，实现了从目标离子对检测到全部目标离子碎片检测的转化。因此，PRM技术不仅具有SRM/MRM的靶向定量分析能力，还同时具备了定性能力。其在定量分析中的优势还体现在：（1）质量精度达到ppm级，能够比SRM/MRM更好地排除背景干扰和假阳性，有效提高复杂背景下的检测限和灵敏度；（2）对子离子进行全扫描，无需选择离子对和优化碎裂能量，更容易进行方法学建立；（3）更宽的线性范围：增加至5-6个数量级。

服务优势

通量高：每个样本30×以上的数据产出量，海量数据用于分析

覆盖度高：能检测到99%的SNP

分辨率高：单碱基分辨率

检测范围广：可得到更加全面、可靠的基因变异信息，如somatic snv、indel和somatic  cnv等

数据质量好：数据偏差小、高均一性，真实反应样本基因组信息

基因组重测序：

对已知基因组进行重测序，可进行CNV、SNP、染色体结构变异等基因组变异的研究，可以此寻找和疾病，如癌症等，相关的生物标记。

宏基因组测序：可对某一环境下的所有微生物进行基因组测序，能够揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。

外显子组序列捕获与测序

通过外显子捕获技术获得外显子区域DNA序列进行测序，可对各种基因突变进行检测，寻找相关的致病基因和易感基因。

iTRAQ技术原理：

iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。

在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。

技术特点:

1．可同时标记2~8 个样本。

2. iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

3.可标记修饰后的氨基酸，因此对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性定量研究。

4.报告离子的相对分子质量较低(113~121)，低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域，因此质谱检测更为灵敏可靠。

iTRAQ试剂包括三部分：

1. 报告基团（reporter group）：相对分子量为113-121Da（无120），因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。

2. 平衡基团（balance group）：相对分子量为192-184Da (无185)，使得八种iTRAQ试剂分子量均为305 Da，保证标记的同一肽段m/z相同。

3. 肽反应基团：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段拿到蛋白样品之后，不同组的样品首先分别进行等量酶切，每一个酶切得到的肽段样品选择一种标记试剂进行标记反应（每一个肽段至少含有一个游离的氨基进行反应）；然后将经过不同标记的肽段样品混合后进行后续的质谱分析。

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