SYA087 肠出血性大肠杆菌溶血素

特别提示：包括肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)单重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)单重荧光PCR检测试剂盒

产品货号：SYA087

产品规格：48次/盒



本试剂盒适用于检测水样粪便、疑似污染的水、食物等样本中的肠出血性大肠杆菌溶血素基因，用于肠出血性大肠杆菌溶血素基因的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。



本试剂盒用一对肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。



试剂盒组成：

组份	数量	规格
Hly反应液(Hly-qPCR MIX)	1管	960μL/管
核酸提取液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(EnzymHly MIX)	1管	48μL/管
阴性对照(NTC)	1管	250μL/管
Hly阳性对照(Hly-PTC)	1管	50μL/管

储存条件：-20℃以下，有效期6个月。



使用方法：



一、样品采集及处理：

1．水样便取0.5-1mL；疑似污染的食物取1g。

2．水样便13000rpm离心2min，去尽上清；疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；疑似污染的水直接取100μL。



二、DNA提取：

对上述处理好的样本加入等体积的核酸提取液(固体标本加入50uL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

DNA的提取也可以采用商业化DNA提取试剂盒。

 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取4μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。



三、检测步骤：

1．试剂的准备

从试剂盒中取出荧光PCR反应液(Hly-qPCR MIX)、酶混合液(EnzymHlyMIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	20μL	N×20μL
酶混合液	1μL	N×1μL
总量	21μL	N×21μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入21μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(Hly-PTC)4μL，10000rpm瞬时离心10秒。

2．qPCR反应条件

将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：

预变性	1循环	94℃ for 2 min
PCR扩增	40循环	94℃ for 15 sec 55℃ for 30 sec

在55℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。



四、结果分析：

1．结果分析条件设定

直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。

2．试验成立判定

?阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。

?阳性对照(Hly-PTC)：均产生扩增曲线。

?以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。

3．结果判定

?在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，且有明显的指数增长曲线，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阳性。

?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阴性。

?如果35＜Ct值，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。

?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阳性；否则判为样本阴性。



五、注意事项：

?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。

?所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。

?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。

?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。



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