BTN90508 包涵体微量纯化试剂盒

特别提示：包括包涵体微量纯化试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：包涵体微量纯化试剂盒

英文名称：Inclusion Body Miniprep Kit

产品货号：BTN90508

产品规格：20次



包涵体是指超表达的蛋白在细胞胞浆内(如果超表达的是胞浆蛋白)或膜间内(如果超表达的是分泌蛋白)凝集形成的无活性的固体颗粒。包涵体形成的主要原因是在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白折叠辅助因子，或环境不适导致无法形成正确的蛋白质次级键。由于包涵体主要由超表达的重组蛋白质组成，因此分离纯化包涵体是分离纯化具有活性的重组蛋白的步。本产品就是用于快速的提取高质量的包涵体。



产品特点：

1．操作简单快速，整个过程只要三十分钟左右。

2．微量纯化，可以在1.5mL离心管中完成。

3．能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。

4．A型用于超声法裂菌，B型用于酶法裂菌。

5．可以选择盐酸胍和尿素两种蛋白溶解方式。

6．得到的包涵体溶解液可以用于重折叠、SDS-PAGE或其他纯化处理。



试剂盒组成：

成分	20T(A型)	20T(B型)
溶液A	5ml	5ml
溶液B	50ml	50ml
包涵体溶解液	5ml	5ml
尿素	5g	5g
溶菌酶	无	600mg
Benzonase(1U/μL)	无	20μl

储存条件：常温运输和保存(B型的溶菌酶和Benzonase 需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。



使用方法：



一、超声法裂菌(只适用于A型)

1．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。zuì好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。

2．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。沉淀(约10mg)放冰上待用或放-80℃保存。

3．加入250μL 冰浴的溶液A，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则不容易沉淀包涵体。

4．直接进入第14步。



二、酶法裂菌(只适用于B型)

5．将600mg 溶菌酶全部加入到5mL溶液A中溶解，然后根据每次的需要量(一次微量提取需要250μl)分成小份放-20℃待用。每次只取用一管。

6．包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶YZ剂混合物(BTN80808)。

7．在蛋白诱导期结束时，转移1.5mL菌液到一个干净的塑料离心管中。zuì好同时处理不加诱导物的细菌做对照样。

8．12000rpm室温离心1分钟，小心弃上清。

9．加入250μL含溶菌酶的溶液A重悬细胞。

10．室温放置10-20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。

11．-20℃冷冻至凝固，一定要凝固到细菌溶液变成固体为止。

12．室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA 将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。zuì好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

13．加入1μL Benzonase(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右，否则还需要延长保温时间。

14．12000rpm 4℃离心5分钟，留存上清作为SDS-PAGE 对照样品一。

15．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

16．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品二。

17．将沉淀(包涵体)悬浮在1mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

18．12000rpm 4℃离心10分钟，留存上清作包涵体洗涤的对照样品三。本产品提供的溶液B足够两次洗涤(两次洗涤一般可得到足够纯净的包涵体)。如果需要更多洗涤，用户需要单独购买包涵体洗涤液(溶液B)

19．沉淀为纯化的包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接用于包涵体溶解。



三、包涵体的溶解：

20.在包涵体沉淀中加入250μL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡室温放置1小时使蛋白质充分溶解。注意：包涵体溶解液含6M 盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样。客户也可以用本试剂盒提供的尿素干粉自配8-10 M 尿素的溶液(尿素溶液不稳定，所以不能长期放置)溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE或后续纯化。但其溶解能力弱于盐酸胍。

21. 20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀(未能溶解的包涵体)。SDS-PAGE 检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

22. 所得蛋白质溶液可以用于复性等试验。用户可本公司购买包涵体复性套装。



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货号	名称	规格
SY0318	免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液	100ml
SY0354	4×Tris-HCl-SDS分离胶缓冲液，pH8.8	250ml
SY0413	27mm透析袋(透析分子量14kDa)	1卷（5米）
JN0190	温和RIPA裂解试剂	100ml|500ml
QN1101	TEMED	100ml
HR0119	高脂肪样本蛋白提取试剂盒	50T|100T
HR8000	细胞蛋白快速提取试剂盒(离心柱法)	50T|100T

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名称：超敏型BCA法蛋白定量试剂盒

货号：BTN80816

规格：500次

本产品是在BCA法蛋白定量试剂盒(BTN80815)基础上改进的超敏蛋白定量试剂盒，尤其适合对低浓度的蛋白质溶液进行定量分析。



产品特点：

1．超敏感，zuì低检测浓度为0.5μg/mL。

2．线性范围在 0.5～20μg/mL，尤其适用于低浓度的样品。

3．对大多数离子型和非离子型去污剂不敏感，但对Cu的还原剂和螯合剂敏感。

4．比 Lowry法更加简单快捷，45分钟内完成测定。

5．试剂稳定，室温可以放置两年，工作液1 天内有效。

6．终产物稳定，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

7．zuì短可以检测双肽，所以适合于分子量较小的蛋白质，而Bradford法需要一定大小的蛋白质。



试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	250ml
溶液B	250ml
溶液C	10ml
BSA标准品(2mg/mL)	1ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存(但BSA 标准品需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。



使用方法：(96板操作模式)

1．将本试剂盒提供的BSA标准品用自备的样品缓冲液稀释成浓度为0.04μg/uL的工作液待用(一次测试所需BSA标准品工作液的用量参见下表)。

2．取一块96孔板，先进行编号(编号可以根据样品数增加)，并按照下表加入BSA工作液、待测样品和样品缓冲液：

编号	BSA工作液 (μL)	待测样品 (μL)	样品缓冲液 (μL)	总体积 (μL)	蛋白含量 (μg)
0	0	0	150	150	0
1	5	0	145	150	0.2
2	10	0	140	150	0.4
3	20	0	130	150	0.8
4	40	0	110	150	1.6
5	60	0	90	150	2.4
6	80	0	70	150	3.2
7	100	0	50	150	4.0
样品1	0	?μl	补到150	150	未知
样品N	0	?μl	补到150	150	未知

3．计算 BCA工作液需要量：根据样品数量(包括制备标准曲线的样品的数量)和每个样品需要0.15mL BCA工作液的比例，计算所需BCA工作液的用量。

4．配制 BCA工作液：先将溶液A、溶液B和溶液C按50：48：2的比例混合，所得溶液即BCA工作液。比如：5mL溶液A + 4.8mL溶液B + 200μL溶液C。

5．将1倍体积(即150μL)的BCA工作液加入到各孔中并混匀。如果用排枪加入并混匀则更好。也可把96孔板放在振荡器上振荡30秒混匀。

6．60℃放置1小时。

7．冷至室温，10分钟内完成后续测定，否则化学反应还在继续进行，光吸收值会慢慢升高，每10分钟会升高2.5%左右。

8．在 562nm下比色测定其余样品的光吸收。如酶标仪没有562nm的设定，可用接近的波长检测，如570nm。

9．将编号为0 号的样品(对照)的读数从其余所有样品(包括0 号样品，其读数变成零)中扣除。

10．以0-7 号样品的BSA含量(μg，见上表zuì右行)为横坐标，以上一步得到的这几个样品的吸光值为纵坐标，绘出BSA的标准曲线。

11．再将待测样品的吸光值(减去0 号样品的读数后)标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量(μg)就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/uL)。



注意事项：

1．加工作液后也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在60℃孵育60分钟。

2．待测样品浓度在20～2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

3．在一定浓度范围内BCA法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响：

名称	在此浓度下不受影响
Ammonium Sulfate	1.5 M
Brij-35	5.0%
CHAPS	5.0%
EDTA	10mM
Hepes	100mM
Glycine，pH2.8	100mM
Guanidine HCl	4.0 M
Tween 20、60、80	5.0%
SDS	5.0%
Sodium Acetate pH5.5	200mM
Sodium Chloride(NaCl)	1.0 M
Sucrose	40%
Sodium Hydroxide(NaOH)	0.1 M
NP-40	5.0%
Triton X-100	5.0%
Urea	3.0 M

4．本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保EDTA浓度不高于10mM，二硫苏糖醇不高于1mM，β-巯基乙醇不高于1mM，没有任何 EGTA，否则建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(BTN80815)。

5．本试剂受温度和时间影响较大，故需要准确定时和定温，以保证精确定量。