BTN100102 一站式His标记蛋白质微量纯化套

特别提示：包括一站式His标记蛋白质微量纯化套装在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：一站式His标记蛋白质微量纯化套装

英文名称：One-Stop His-Tagged Protein Miniprep Pack

产品货号：BTN100102

产品规格：2mL



本试剂盒基于His-Ni亲和层析的蛋白质纯化方法，是目前分离纯化重组表达蛋白质的重要方法，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品。



特点：

1. 一站式套装，含所需的介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达His蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。

2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的His-标记蛋白。

3. 变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。

4. 每次可以处理20mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。

5. 提供4mL浓度为50%的Ni-Agarose介质，其zuì大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质。

6. 介质为CL-6B琼脂糖，含四个Ni离子螯合基团，比只有四个Ni离子螯合基团的Ni-IDA更有效。

7. 本介质可以反复使用多次。



产品组成：

组分	编号	规格
Ni-Agarose介质，50%	BTN100101	4mL
1M咪唑溶液	BTN100102a	25mL
1M Tris-HCl溶液，pH7.9	BTN100102b	25mL
5 M NaCl溶液	BTN25-06290	25mL
溶菌酶（20KU/mg）	BTN100102b	30 mg(低温)
Benzonase溶液（2U/uL）	BTN100102c	20μl(低温)
盐酸胍	50-01-1	6 g
尿素	57-13-6	20 g
PMSF溶液（10mg/mL）	BTN100833	0.5mL(低温)
亲和层析柱，6mL	BTN110809	1套

保存条件：常温运输和保存，但介质长期需4℃保存，溶菌酶、Benzonase溶液和PMSF溶液需-20℃保存，有效期一年



自备试剂：去离子水、20%乙醇、0.45μm滤膜



使用方法：

1. 将Ni-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据His蛋白产量决定，其zuì大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质，请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱）。

2. 用5倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。

3. 用5倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下，以10mL为例），共三次：

成分	用量	在结合缓冲液中的浓度
1 M Tri-HCl（pH7.9）	0.2mL	20 mM
1 M 咪唑溶液	0.1mL	10 mM
5 M NaCl溶液	1mL	500 mM
自备去离子水	8.7mL

4. 室温5000 g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，沉淀（约100 mg）放冰上待用或放-80℃保存。zuì好用不加诱导物的菌液做对照样。

5. 如果超声破碎细菌：加入1mL冰浴的结合液（1mL菌液需要用50μl结合液），再加入25μl PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。如果酶法裂解细菌：加入1mL冰浴的含溶菌酶的结合液（先取20mL结合液，加入所有30 mg溶菌酶干粉，溶解后分装成1mL/管，剩余的-20℃放置），再加入25μl PMSF（10mg/mL）溶液和1μl Benzonase，冰上放置30分钟。

6. 4℃下13000-15000 g离心10分钟，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的His标记蛋白，则直接进入第7步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）中的His标记蛋白，则直接进入第12步。



A、纯化细胞裂解液中可溶部分的His标记蛋白

7. 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。

8. 用10倍柱体积结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。

9. 如果用一步式洗脱法（适合已经找到zuì佳咪唑浓度的情况），则直接用适量的新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含His标记蛋白）。洗脱液的配方如下（以1mL体积和zuì佳咪唑浓度是500 mM为例）：

成分	用量	在洗脱液中的浓度
1 M Tri-HCl（pH7.9）	20μl	20 mM
1 M 咪唑溶液	500μL	500 mM
5 M NaCl溶液	100μL	500 mM
自备去离子水	380μL

10. 如果用多步式洗脱（适合不知道zuì佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如40、60、100、200、300和500 mM），其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。

11. 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），zuì后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。



B、纯化包涵体中His标记蛋白

12. 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1-3mL含盐酸胍结合液中或1-3mL含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴1小时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以10mL为例）：

成分	含盐酸胍结合液	含尿素结合液
1M Tri-HCl（pH7.9）	200μl	200μl
5M NaCl溶液	1mL	1mL
盐酸胍（MW=95.6）	5.7 g	无
尿素（MW=60.1）	无	4.8 g
自备去离子水	加水到10mL	加水到10mL

13. 室温10000×g离心20分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的His标记蛋白）以自备的0.45 μm滤膜过滤。

14. 将滤过液上柱，后续纯化步骤同第7-第11步。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以1mL为例）：

成分	含盐酸胍洗脱液	含尿素洗脱液
1M Tri-HCl（pH7.9）	20μL	20μL
1M 咪唑溶液	500μL	500 μL
5M NaCl溶液	100μL	100μL
盐酸胍（MW=95.6）	0.57 g	无
尿素（MW=60.1）	无	0.48 g
自备去离子水	加水到1mL	加水到1mL

注意事项：

整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分。若洗脱液不能将His标记蛋白洗脱下来，可改用pH 6.5- 4.5的pH递减的Tris-HCl洗脱。



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试剂盒组份：

染色液——————————————200ml

漂洗液(10×)———————————60ml

脱色液(10×)———————————40ml



产品特点：

1.无背景染色，敏感度高，比传统丽春红染色高10倍。

2.蛋白染成翠兰色，解决了丽春红染色红色不易照相保存的问题。

3.可逆染色，完全不影响蛋白性质，不影响抗体抗原结合性质Western blot实验，和质谱分析、N末端测序等兼容。

4.推荐使用硝酸纤维素膜，大部分情况染膜效果优于PVDF膜。



储存条件：室温，有效期12个月。



本制品别名：Western blot转膜效果检测试剂盒|硝酸纤维素膜蛋白染色试剂盒|转膜蛋白染色试剂盒|NC膜蛋白染色试剂盒|PVDF膜蛋白染色试剂盒