HR0111 线粒体膜蛋白提取试剂盒

特别提示：包括线粒体膜蛋白提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：线粒体膜蛋白提取试剂盒

英文名称：Mitochondrial membrane protein extraction kit

产品货号：HR0111

产品规格：50T|100T



线粒体膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取线粒体膜蛋白。提取过程简单方便。制备的线粒体膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。



储存条件：蛋白提取液2-8℃保存；蛋白溶解液室温保存；蛋白酶YZ剂-20℃保存。

有效期：一年。



注意事项：

●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或ZL。

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

● 禁止与其他品Pai的试剂混用，否则会影响使用效果。

● zuì好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。



产品特点：

1．使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。

2．将蛋白提取的时间缩短至 30分钟-1小时。

3．含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

4．紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

5．蛋白酶YZ剂YZ了蛋白的降解，蛋白酶YZ剂配方优化。蛋白酶YZ剂混合物包含7种独立的蛋白酶YZ剂；每一种YZ剂可特异性YZ某一种或几种蛋白酶活性。

该混合物优化的组成使其可以YZ几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。



试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 移液器、吸头 ●离心机及离心管

● 涡旋振荡器 ●冰箱，冰盒



使用方法：



使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

●蛋白酶YZ剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

●可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶YZ剂单品。



1．取2×107个细胞①，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2．用冷 PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3．加入 200μl冷的试剂A，置冰上10分钟。

4．匀浆器匀浆 30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。

5．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。

6．在 4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。

7.在沉淀中加入200μl冷的试剂B，混匀。

8.在 4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。。

9．弃上清。

10.在沉淀中加入200μl冷的试剂C，2μl蛋白酶YZ剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上20分钟，每隔5分钟高速涡旋振荡15秒。

11．37℃水浴10分钟。

12．37℃下②2000g离心5分钟，此时溶液分为两层(对着光线看)，下层约为20μl。

13.小心吸取上层丢弃或小心吸出下层。

14．用80-150μl冰冷的膜蛋白稀释液稀释下层相，即得线粒体膜蛋白。

15．将上述蛋白提取物定量③后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

【注】：

①细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。

② 必需保证在 37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2-3分钟。

③ 建议用 BCA 法进行蛋白定量。

④蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。



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名称：包涵体中量纯化试剂盒

货号：BTN90509

规格：5次

本产品是我们公司包涵体微量纯化试剂盒(BTN90508)的中量提取升级产品，用于中量，快速的提取高质量的包涵体。



产品特点：

1．中量提取，一次可以处理30-50mL的菌液，一次中量提取相当于10-20次微量提取。

2．操作简单快速，整个过程只要四十分钟左右。

3．大规模提取，可以在15-50mL离心管中完成。

4．能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。

5．细胞裂解通过非离子洗涤剂的化学裂解法，裂解更加温和。

6．得到的包涵体可以用于重折叠。



试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	25ml
溶液B	250ml
包涵体溶解液	25mL
溶菌酶	3g
Benzonase(1U/μL)	125μl
说明书	1份

储存条件：常温运输及保存，但溶菌酶和Benzonase需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。



使用方法：



准备工作：

将3g溶菌酶全部加入到25mL溶液A中溶解，然后根据每次的需要量(一次大量提取需要5mL)分成1mL/只放-20℃待用。每次只取用一管含溶菌酶的溶液A。

包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶YZ剂混合物(BTN80808)。



一、细胞裂解和包涵体的纯化：

1．在蛋白诱导期结束时，转移30mL菌液到一个干净的塑料离心管中。

2．5000-7,000rpm室温离心3分钟，小心弃上清。

3．加入5mL含溶菌酶的溶液A重悬细胞。

4．室温放置10-20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。

5．-20℃冷冻至凝固。凝固有利于裂解细菌，所以一定要凝固到细菌溶液变成固体。

6．室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复3-6步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。如有条件zuì好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

7．加入25μL的Benzonase(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右(检查方式是将裂解物倾倒转移到另一离心管中，在转移过程中看其是否粘稠)。

8．5000-7,000rpm 4℃离心5分钟，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。

9．将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在25mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

10．5000-7,000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清,可以作为包涵体次洗涤的对照样品。

11．将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在25mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。

12．5000-7,000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤的对照样品。一般洗涤两次就能够得到足够纯净的包涵体，如果需要更多洗涤，需要用户单独购买包涵体洗涤液(溶液B)。

13．得到的沉淀即为包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接进入包涵体的溶解步骤。



二、包涵体的溶解：

1．在包涵体沉淀中加入5mL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果低温放置，包涵体溶解液会产生沉淀，必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。

2．室温放置1小时使蛋白质充分溶解。

3．20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

4．得到的蛋白质溶液可以用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的zuì佳复性条件，所以本公司不能提供统一的复性溶液，需要用户自己摸索。

 注意：包涵体纯化过程中引入了溶菌酶、DNase和RNase等外源蛋白质，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。