microRNA检测

microRNA简介
       microRNA(miRNA)是一类进化上保守、内源性、长度为20-24个核苷酸的非编码RNA。成熟的miRNA可识别一种或多种mRNA，降解靶mRNA或者阻遏其翻译。miRNA在细胞生长与发育过程中起多种作用，包括发育、疾病、细胞增殖与凋亡等。
       基于实时荧光定量PCR技术对miRNA是实验室Z常用的检测方案。主要分为：Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法及Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法。
Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法：
       Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法因逆转录的特异性，检测灵敏度高，也可特异性地分辨出miRNA 5p、3p形式，及各种前体。
Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法：
        Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法可一次性对RNA样本逆转录出多种miRNA，适合多种miRNA定量检测，但该方案检测灵敏度低，且不能区分剪接成熟体（5p或3p）。
        翼和生物采用Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法为主要的实验方法提供miRNA定量服务。

技术原理

•  步：基于Stem-Loop引物的逆转录反应；
•  第二步：通过SYBR法实时检测PCR产物。（图1所示） 

 技术特点

• 特异性好：可有效区分成熟miRNA中5p和3p形式；
• 效率高：可对多个miRNA同管逆转录，节约样本资源与反应成本；
• 检测分辨度高：可有效分辨低至10%的表达量差异（图1）；
•  重复性好：在对已知浓度miRNA进行梯度稀释后，线性关系好R2＞0.99（图2）；
• 准确性高：一个或多个参照基因与检测基因在同一管内RT反应，定量检测后校正表达量；

数据分析
       利用本方法对野生型小鼠30-6与转基因小鼠30-1、26-4、26-6、26-7的丘脑（H）与卵巢（O）mir505的3p和5p两种形式进行定量检测，扩增曲线如下图和转基因相对表达量如右柱状图示。