JN0052 两步法RT-qPCR试剂盒

特别提示：包括两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)

英文名称：SYBR Two-Step qRT-PCR UltraMix

产品货号：JN0052

产品规格： 50次RT+300次qPCR



  本试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用Balbscript All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix进行反转录，用Balbscript SYBR qRT-PCR UltraMix进行荧光定量。具有灵敏度高，合成能力强，扩增效率高的优点。

  本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。



操作方法：

一、链cDNA合成

融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

1、按顺序加入下面的反应物

加入物	加入量
模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg)
PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	10μl
RNase Free Water	至20μl

2、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却。

3、轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。

4、70℃加热5min终止反应。

  反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。

二、实时定量

合成的链cDNA可直接用于PCR或qPCR。链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，链cDNA反应液加入2μl。

·用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有：

Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus；其他仪器。

·用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有：

Applied Biosystems 7500/7500 Fast；Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P；其他仪器。

·不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有：

Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4；Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；R℃he Applied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000；其他仪器。



注意事项：

1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。

2、确保所用试剂中无RNA酶污染。

3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。

4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。



储存条件：-20℃



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储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。



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